hUC-MSCs源性神經干細胞樣細胞對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

王素平,鐘亮,蘭小磊,翟秋月,張睿

(1 青島市第三人民醫院神經康復科,山東 青島 266041; 2 青島大學附屬醫院神經外科; 3 青島大學附屬醫院神經外科監護室)

缺血性卒中發生率很高,組織纖溶酶原激活劑靜脈溶栓是目前的主要治療手段[1-3],但該治療窗口狹窄且使出血轉化的可能性增大[4-5]。臨床上,腦缺血再灌注損傷可導致廣泛的神經血管損傷和神經功能障礙[6-7]。由于中樞神經系統自我修復的能力有限,因此,替代方法將有望改善腦缺血再灌注的治療[8]。神經干細胞(NSCs)能分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞,具有補償內源性神經細胞不足和改善細胞存活的炎癥微環境的能力[9]?；贜SCs的細胞治療成為腦缺血再灌注損傷的一種新型治療策略。本研究將人臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)誘導成神經干細胞樣細胞(NSCLCs)后移植至缺血再灌注損傷大鼠腦內,旨在探討NSCLCs移植對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

hUC-MSCs無血清培養基購自上海弗元生物科技有限公司;上皮細胞生長因子(EGF)以及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購自美國PreproTech公司;B-27TM添加劑購自美國Gibco公司;性別決定區Y-Box2(SOX2)抗體購自武漢Proteintech公司;Nestin抗體購自美國STEMCELL公司;NeuN抗體購自武漢ABclonal公司;Hoechst 33342染色液及熒光二抗購自上海碧云天公司;改良蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 實驗方法

1.2.1hUC-MSCs誘導形成NSCLCs 經青島大學附屬醫院倫理委員會審議批準(QYFY WZLL 26435)、產婦知情同意后,取足月分娩的健康胎兒臍帶10～15 cm(包含臍帶和胎盤連接處5～6 cm)。采用機械分離培養組織塊的方法分離獲得hUC-MSCs,將獲得的hUC-MSCs進行傳代培養。取傳至第6～8代的hUC-MSCs,將其接種至低吸附六孔板中,加入NSCLCs誘導培養液(DMEM/F12+20 μg/L EGF+20 μg/L bFGF+20 g/L B27),每隔2 d換一次液,誘導7 d后收集獲得NSCLCs,細胞密度為1×1010/L[10]。

1.2.2動物分組及處理 雄性Sprague Dawley大鼠30只,體質量250～280 g,由北京維通利華公司(SCXK(京)2016-0011)提供,在實驗動物中心適應性飼養7 d,術前禁食12 h。隨機取8只大鼠作為假手術組(Sham組),剩余22只大鼠用于構建大腦中動脈閉塞/再灌注(MCAO/R)模型(MCAO/R組)及造模后NSCLCs治療(NSCLCs組),MCAO/R組和NSCLCs組每組至少8只大鼠存活。治療7 d后處死大鼠取腦組織用于后續研究。所有動物實驗均經青島大學和青島大學附屬醫院倫理委員會批準(批準號20210720SD15020211230062,QYFY WZLL 26598)。

1.2.3MCAO/R模型構建及NSCLCs移植 大鼠稱體質量,應用100 g/L的水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉以后,仰臥位固定,分離出頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)以及頸外動脈(ECA)。結扎ECA遠心端,在其近心端和遠心端之間剪出一缺口,將線栓由ECA缺口插入,插至深度為18～22 mm處,微感阻力即可,缺血90 min后,將線栓緩慢拔出完成缺血再灌注。NSCLCs移植方法參照已有的相關研究[11],在線栓拔出時,將注射用軟管從ECA殘端經CCA到達ICA,設置微量注射泵,5 min內注射100 μL的細胞懸液,注射細胞數目為1×106個。

1.2.4改良神經功能缺損評分(mNSS評分) 基于已有的相關研究,采用mNSS評分表評估各組大鼠神經行為功能[12]。mNSS評分表包括肌張力、運動、感覺、平衡和反射指標檢測,總分為18分,評分越高說明神經系統損傷越嚴重。

1.2.5細胞免疫熒光染色 收集NSCLCs用PBS洗滌,以40 g/L多聚甲醛固定。透膜后,室溫封閉1 h。加一抗SOX2和Nestin(1∶100)在4 ℃下孵育過夜。次日,滴加熒光二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h后,用Hoechst 33342對細胞核進行染色。

1.2.6HE染色 取各組大鼠缺血皮質區域腦組織進行石蠟包埋并切片。按照說明書指示進行脫蠟水化、蘇木精染色、分化液分化、返藍液返藍、伊紅染色,脫水及透明后封片。光鏡下觀察,視野內蘇木精所染細胞核的數目記為細胞總數,變性細胞通常表現為細胞核皺縮且著色加深。每張切片隨機選取5個不重疊的視野,采用Image J軟件統計損傷神經元比例,即變性細胞指數(DCI),DCI=變性細胞數目/細胞總數。實驗重復3次。

1.2.7免疫組化染色 取各組大鼠缺血皮質區域腦組織石蠟切片,干燥后經二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化。經檸檬酸抗原修復液進行抗原修復后,封閉30 min,加一抗NeuN(1∶100)4 ℃孵育過夜。次日,加熒光二抗37 ℃孵育1 h,Hoechst 33342染核后加入抗熒光淬滅劑封片。熒光光鏡下觀察,每張切片隨機選取5個不重疊的視野,采用Image J軟件統計NeuN陽性細胞數目。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 NSCLCs形成及鑒定

第6代的hUC-MSCs貼壁生長呈長梭形,懸浮培養誘導至第7天時,形成克隆球狀NSCLCs(圖1A)。細胞免疫熒光染色的結果顯示,NSCLCs呈NSCs表面關鍵特異性抗原SOX2(綠色)和Nestin(紅色)陽性(圖1B)。

A:第6代的hUC-MSCs形態學(左)及誘導第7天的NSCLCs形態學(右);B:克隆球免疫熒光染色。①復合染色,②紅色Nestin,③綠色SOX2,④藍色Hoechst。比例尺50 μm。

2.2 NSCLCs治療對MCAO/R大鼠行為學評分的影響

mNSS評分結果顯示,3組mNSS評分差異有統計學意義(F=5.119,P<0.05)。兩兩比較結果顯示,與MCAO/R組相比,NSCLCs組治療7 d后的行為學評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組mNSS評分、DCI和NeuN表達比較

2.3 NSCLCs治療對MCAO/R大鼠神經元損傷的影響

缺血皮質區HE染色結果顯示,Sham組神經元排列整齊,輪廓清晰,細胞核著色均勻;MCAO/R組細胞核著色加深且固縮,細胞排列無序;NSCLCs治療后,細胞損傷情況得到改善(圖2)。3組DCI比較差異有統計學意義(F=173.928,P<0.01)。兩兩比較結果顯示, MCAO/R組DCI較Sham組顯著升高(P<0.01),NSCLCs組DCI較MCAO/R組顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.4 NSCLCs治療對MCAO/R大鼠NeuN表達的影響

大鼠缺血皮質區免疫組化染色結果顯示,3組NeuN陽性細胞數目差異有顯著意義(F=73.120,P<0.01)。兩兩比較結果顯示,與Sham組相比,MCAO/R組NeuN陽性細胞數目顯著減少(P<0.01);與MCAO/R組相比,NSCLCs組NeuN陽性細胞數目顯著增多(P<0.05)。見圖3、表1。

綠色熒光標記細胞為NeuN陽性細胞,放大200倍。

3 討 論

目前,針對缺血性腦卒中,臨床治療方法主要是盡早恢復大腦局部血流供應,從而降低腦卒中發病后死亡、殘疾或者功能障礙的發生率以及嚴重程度[13]。由于病人年齡、缺血部位和時間及局部神經細胞自我修復能力等因素存在差異,部分病人治療后可能由于血流量的恢復而加劇腦損傷,即誘發缺血再灌注損傷,因而引起的癱瘓、感覺減退、失語、吞咽困難和認知障礙的發生率很高,加之中樞神經系統的再生能力有限,腦缺血再灌注損傷病人往往終身殘疾[14-15]。研究表明,干細胞移植治療逐漸成為腦缺血再灌注損傷的新療法[16]。NSCs由于可以分化成多種類型的神經細胞,已成為治療腦缺血再灌注損傷的理想候選干細胞類型[17]。然而,NSCs的獲取和移植后在富含活性氧、炎癥因子缺血微環境中的低存活率和低分化率限制了其臨床應用[18]。因此,尋找合適的NSCs來源,探索其對腦缺血再灌注損傷的臨床治療具有重要意義。

相關研究結果表明,間充質干細胞(MSCs)在某些特定的條件下可以分化為NSCs或者神經祖細胞(NPC)[19-20]。bFGF和EGF是誘導MSCs成為NSCs的關鍵因子,且生長因子誘導的NSCs存活時間明顯長于化學誘導者[21]。本研究在此基礎上,添加EGF和bFGF誘導hUC-MSCs形成NSCLCs,并探究NSCLCs移植后對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用。

動物行為學檢測指標是判斷腦缺血再灌注損傷治療效果的重要指標之一[22]。本研究結果表明,NSCLCs移植后大鼠的神經行為學評分較MCAO/R組顯著提高,表明NSCLCs治療可以改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能缺損。腦缺血再灌注發生可導致神經元損傷加劇,加上神經元自身無法再生,因此,減輕神經元損傷、促進其再生是治療腦缺血再灌注損傷的重要思路之一[14]。本實驗HE染色和神經元NeuN表達檢測結果顯示,NSCLCs治療可顯著改善MCAO/R導致的神經元損傷,并增強NeuN表達水平。

綜上所述,本研究通過細胞因子誘導法實現了hUC-MSCs向NSCLCs的誘導分化,并初步證實了NSCLCs移植對MCAO/R損傷大鼠具有較好的治療效果,這為腦缺血再灌注損傷的治療提供了新的思路。