生物通風法修復石油烴污染土壤

殷鸝婷，韓書新，刁志龍，王 勇，蔣夢涵，高煥方

（1. 重慶理工大學 化學化工學院，重慶 400054；2. 黑龍江省生態氣象中心，黑龍江 哈爾濱 150030；3. 重慶匯亞環保工程有限公司，重慶 400041；4. 正和綠源檢測技術（重慶）有限公司，重慶 400072）

石油烴（TPH）是一種持久性有機污染物，具有致癌、致畸和致突變性［1-2］，主要來自于石油開采、運輸及加工過程中泵、管線、油罐等設施和設備的泄漏。TPH一旦進入土壤，一方面會通過食物鏈在人和動物體內富集，對人體健康造成危害；另一方面還會破壞土壤結構、抑制植物生長，對生態環境造成嚴重危害。近年來，TPH污染已逐漸成為石油、石化行業土壤污染的主要形式。TPH污染土壤的修復方法主要有物理修復、化學修復和生物修復3種。其中，物理修復（如吸附、熱處理、隔離等）和化學修復（如萃取、淋洗、化學氧化等）處理成本高、二次污染嚴重［3-5］，生物修復雖然具有修復效果好、處理費用低、不產生二次污染等優點，但卻存在耗時長的缺陷。生物通風是將物理修復與生物修復結合起來的一種土壤修復技術，對TPH污染土壤具有良好的修復效果［6］。THOMé等［7］利用生物通風技術修復受柴油污染的黏土土壤，120 d后，TPH去除率達到85%。張煜軒［8］采用異位生物通風技術修復焦化類污染土壤，考察了通風條件和菌劑添加量對修復效果的影響，結果表明，在96 d的試驗周期內，目標污染物苯并［a］芘、苯并［a］蒽和二苯并［a，h］蒽等均有良好的去除效果。盡管生物通風技術在TPH污染土壤修復方面已有應用，但鑒于TPH污染土壤本身的復雜性，目前對于影響生物通風修復效果的因素，如初始TPH含量、土壤含水率、通風強度和通風時間等的研究還不夠透徹，對微生物降解TPH的機理也不甚清楚，亟需深入研究［9-11］。

本工作采用生物通風技術修復受TPH污染的土壤，考察了初始TPH含量、土壤中C，N，P元素質量比（C∶N∶P）、土壤含水率和通風速率4種因素對TPH降解率的影響，探討了TPH的降解機制，為TPH污染土壤的修復作參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和儀器

土壤取自重慶理工大學校園內，采集表層（0～15 cm）土樣，自然風干后，過2 mm篩備用。經檢測，土壤pH 7.74、含水率4.81%、有機質含量（w）1.40%。

TPH污染土壤的制備：將40#機油在適量石油醚中溶解，加入土壤中，充分混合，制備成不同TPH含量（分別為6 000，8 000，10 000，12 000，14 000 mg/kg）的污染土壤；將污染土壤在陰涼通風處放置14 d，每2 d攪拌1次，以確保石油醚完全揮發。

實驗所用菌液是由4株真菌所構建的高效TPH降解菌群。4株真菌分別為硬孔菌（Rigidoporus vinctus）、雜色曲霉菌（Aspergillus versicolor）、淡紫擬青霉菌（Purureocillium lilacinum）和曲霉菌（Aspergillus japonicus），均為本課題組篩選所得。

GC-2014型氣相色譜儀：日本島津公司；Agilent 8860-5977B型氣相色譜質譜聯用儀（GCMS）：美國安捷倫公司；SEP-100型生化培養箱：上海精其儀器有限公司。

1.2 實驗裝置

實驗裝置圖見圖1。整個實驗裝置由生物通風柱（由有機玻璃柱制成，內徑80 mm、高500 mm）、充氣泵、氣體流量計、裝有NaOH溶液的CO2去除瓶、裝有NaOH溶液的CO2收集瓶和活性炭管等組成。生物通風柱側壁設置6個直徑均為10 mm的圓形取樣口（從下到上分別記作A#-F#），取樣口高度距柱底分別為60，110，195，285，370，415 mm，取樣口用硅膠墊密封。

圖1 實驗裝置圖

1.3 實驗方法

1.3.1 單因素實驗

在TPH含量為10 000 mg/kg的污染土壤中分別添加一定量的硝酸銨和磷酸氫二鉀，調節土壤C∶N∶P為100∶15∶1；將污染土壤裝填至生物通風柱中，填充高度430 mm；在通風速率150 mL/min的條件下，考察土壤含水率對TPH降解率的影響。分別改變C∶N∶P、通風速率和初始TPH含量，考察不同因素對TPH降解率的影響。

1.3.2 正交實驗

為了進一步考察不同因素對TPH降解率的影響，在單因素實驗的基礎上，設計了4因素3水平L9（34）的正交實驗（表1），考察修復期間（0～63 d）污染土壤中TPH降解率的變化情況。

表1 生物通風修復TPH污染土壤正交實驗因素與水平

1.4 分析方法

采用氣相色譜儀測定土壤樣品中TPH的含量［12］，結果取6個采樣點的平均值。

采用GC-MS測定TPH降解產物。具體步驟如下：生物通風結束后，從6個取樣口中各稱取5.0 g左右的土壤樣品加入到研缽中，同時加入等質量的無水硫酸鈉，研磨至干燥態；將樣品移入微波消解管中，加入20 mL體積比為1∶1的丙酮-正己烷混合溶液，在120 ℃下微波萃取30 min；萃取液經濃縮、干燥后，定容至1 mL，上機檢測。測試條件：色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至320 ℃并保持59 min。不分流，進樣量1 μL。質譜采用EI離子源，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃。

2 結果與討論

2.1 影響TPH降解率的因素

2.1.1 土壤含水率

在初始TPH含量為10 000 mg/kg、通風速率為150 mL/min、C∶N∶P為100∶15∶1的條件下，考察土壤含水率對TPH降解率的影響，結果見圖2。

圖2 土壤含水率對TPH降解率的影響

由圖2可見：隨著修復時間的延長，TPH降解率逐漸增加；當土壤含水率從10%增加到20%時，TPH的降解率不斷上升，當修復時間為35 d時，TPH降解率達到最大，為37.7%；繼續增加土壤含水率至25%和30%時，TPH降解率明顯降低。研究表明，適宜的土壤含水率不僅可以促進微生物的代謝活動，增加其細胞活性，還能夠維持土壤孔隙，增加土壤供氧能力，有利于好氧微生物發揮作用［13］。當土壤含水率過低時，營養物質不能及時傳遞給微生物，導致微生物活性受到抑制，呼吸作用減弱，從而影響TPH的降解；隨著土壤含水率的逐漸增大，土壤中越來越容易形成厭氧環境，不利于好氧微生物的生長；當土壤含水率超過25%時，土壤呈泥漿狀，土壤孔隙度降低，氧氣難以擴散，進而影響微生物活性，TPH降解率降低［14］。一般認為土壤含水率為 15%～20%時，生物修復的效果最佳［15］。綜上，選擇適宜的土壤含水率為20%。

2.1.2 C∶N∶P

在初始TPH含量為10 000 mg/kg、土壤含水率為20%、通風速率為150 mL/min的條件下，考察C∶N∶P對TPH降解率的影響，結果見圖3。

圖3 C∶N∶P對TPH降解率的影響

由圖3可見：當C∶N∶P由100∶10∶1增加至100∶20∶1時，TPH降解率逐漸增大；當C∶N∶P為100∶20∶1、修復時間為35 d時，TPH降解率達到最大，為39.4%；繼續增加C∶N∶P至100∶25∶1和100∶30∶1時，TPH降解率逐漸降低。土壤中C，N，P等營養物質的含量對微生物降解TPH影響較大。一方面微生物的生長代謝離不開C，N，P等營養物質，TPH可以為微生物生長提供碳源，N、P等營養物質能夠促進細胞生長、增強微生物活性、加速微生物對TPH的降解。另一方面，當N、P等營養物質含量過高時，會對微生物生長產生毒害作用，不利于微生物產生相應的降解酶，降低了微生物對TPH的降解率［16-18］。綜上，選擇適宜的C∶N∶P為100∶20∶1。

2.1.3 通風速率

在初始TPH含量為10 000 mg/kg、土壤含水率為20%、C∶N∶P為100∶20∶1的條件下，考察通風速率對TPH降解率的影響，結果見圖4。由圖4可見：當修復時間為0～7 d時，隨著通風速率的增加，TPH降解率逐漸增加；隨著修復時間的延長，當通風速率由50 mL/min增加至100 mL/min時，TPH降解率逐漸增大，繼續增加通風速率至150 mL/min，TPH降解率略有降低，進一步增大通風速率至250 mL/min時，TPH降解率明顯降低；當通風速率為100 mL/min、修復時間為35 d時，TPH降解率達到最大，為 40.3%。在修復初期（0～7 d），微生物尚未適應新的土壤環境，此時TPH的去除主要依靠揮發作用，隨著修復時間的延長，微生物逐漸適應土壤環境并開始大量繁殖，因此，修復中、后期，TPH的去除主要依賴微生物的降解作用。土壤中氧含量是影響TPH生物降解率的主要因素［19］。微生物在有氧條件下，以TPH為碳源和能源進行代謝合成自身物質，當土壤中氧含量不足時，會抑制好氧微生物的生長，進而影響對TPH的降解，當土壤中氧含量充足時，TPH容易被微生物降解。適當的通風速率可以保證土壤中氧含量充足，但通風速率過大可能會使土壤內部溫度降低，進而影響微生物的活性，導致TPH降解率下降［20］。綜上，選擇適宜的通風速率為100 mL/min。

圖4 通風速率對TPH降解率的影響

2.1.4 初始TPH含量

在土壤含水率為20%、C∶N∶P為100∶20∶1、通風速率為100 mL/min的條件下，考察初始TPH含量對其降解率的影響，結果見圖5。由圖5可見：當初始TPH含量由6 000 mg/kg增加至10 000 mg/kg時，TPH降解率逐漸增大；在修復中、后期，初始TPH含量增加至12 000 mg/kg和14 000 mg/kg時，TPH降解率逐漸降低；當初始TPH含量為10 000 mg/kg、修復時間為35 d時，TPH降解率達到最大，為43.1%。TPH可以為微生物生長提供豐富的碳源，當土壤中初始TPH含量過低時不足以維持微生物的生長繁殖［21］，導致TPH降解率較低；隨著土壤中初始TPH含量的升高，微生物的生長繁殖加快，微生物數量增多、活性增強，對TPH的降解率增大；當初始TPH含量過高時，會影響土壤的呼吸強度，阻礙土壤中營養物質和氧氣的傳輸，抑制微生物的活性，導致TPH降解率降低［22-23］。綜上，選擇適宜的初始TPH含量為10 000 mg/kg。

圖5 初始TPH含量對其降解率的影響

2.2 正交實驗結果分析

為了進一步優化生物通風修復TPH污染土壤的工藝條件，在單因素實驗的基礎上開展正交實驗，考察不同因素對TPH降解率的影響，結果見表2。由表2可見：生物通風修復TPH污染土壤的最佳實驗條件為A2B1C3D2，即初始TPH含量10 000 mg/kg、C∶N∶P 100∶15∶1、土壤含水率20%、通風速率100 mL/min。在最佳實驗條件下修復63 d后，污染土壤中TPH的含量降低至3 167 mg/kg，降解率為68.3%；各因素對TPH降解率影響的大小順序為初始TPH含量（A）＞土壤含水率（C）＞C∶N∶P（B）＞通風速率（D），表明初始TPH含量是影響其降解率的最主要因素，這與李琦［24］的研究結果相一致。

表2 正交實驗結果

2.3 TPH降解產物及降解機理

以TPH降解率最高的生物通風柱為對象，采用GC-MS分析土壤修復前后TPH組分和含量的變化，結果見圖6。按碳骨架類型的不同，TPH可分為脂肪族、脂環族和芳香族化合物3類。由圖6a可見：生物通風前后，各TPH組分含量的變化明顯不同，其中脂肪族化合物的相對含量顯著降低，由修復前的27.9%降低至12.5%，脂環族和芳香族化合物的相對含量有所增加，分別由修復前的52.5%和19.6%增加至61.3%和26.3%，表明脂肪族化合物比脂環族和芳香族化合物容易被降解，即具有開鏈碳結構的TPH比具有環狀碳結構的TPH更容易被微生物降解。從TPH碳鏈的長短來看（圖6b）：生物通風修復后，C10～C16的相對含量明顯降低，由修復前的31.1%降低至16.7%；C17～C21和C22～C40的相對含量有所升高，分別由修復前的24.0%和44.9%升高至29.2%和54.2%，可見，TPH的碳鏈越短越容易被微生物降解。

圖6 修復前后土壤中各TPH組分和含量的變化

生物通風修復前，采用GC-MS可以從TPH污染土壤中檢測到9，10-二甲基蒽（見圖7）；經生物通風修復后，從TPH污染土壤中只能檢測到10-甲基蒽-9-甲醛（圖8）?？梢哉J為這是9，10-二甲基蒽上的甲基經加氧酶氧化成酚羥基、再經過脫氫酶還原成醛的過程，表明此時多環芳烴已開始降解。此外，在修復前的TPH污染土壤中可以檢測到1-氯代二十碳烷，在修復后的土壤樣品中只能檢測到二十烷，表明鹵代脂肪烴已經開始取代脫氯，長鏈烷烴也開始降解。在適宜的條件下，TPH作為碳源，為微生物的生長繁殖提供能量，在一系列酶的作用下，微生物通過氧化、水解、烷基化和去烷基化等代謝方式將TPH逐步降解為CO2和H2O等，且TPH的結構越簡單，越容易被降解［25-26］。

圖7 9，10-二甲基蒽的質譜圖

圖8 10-甲基蒽-9-甲醛的質譜圖

不同TPH的好氧降解過程見圖9。由圖9可見：鏈烷烴的降解主要為末端氧化和次末端氧化。在末端氧化過程中，鏈烷烴被烷烴加氧酶依次氧化為伯醇、脂肪酸或醛，脂肪酸經過β-氧化進一步轉化為乙酰輔酶A（CoA），隨后進入三羧酸（TCA）循環被進一步分解，最終產物為CO2和H2O。烷烴發生次末端氧化時會首先形成仲醇，仲醇再轉化為甲基酮，酮進一步代謝為酯，隨后生成脂肪酸和伯醇，伯醇繼續氧化為羧酸，羧酸與脂肪酸經過β-氧化后，進一步分解為CO2和H2O［27］。

圖9 不同TPH的好氧降解過程

與鏈烷烴相比，環烷烴較難被微生物降解。其降解路徑為：環烷烴首先經氧化酶氧化成環醇，脫氫后形成環酮，環酮可以進一步氧化生成內酯、也可以開環生成脂肪酸，再通過β-氧化最終分解為CO2和 H2O［28］。

以苯為例，芳香族化合物的降解路徑為：加氧酶將苯環羥基化生成鄰苯二酚，再經過鄰苯二酚雙加氧酶的作用在鄰位或間位開環，其中鄰位開環生成己二烯二酸，己二烯二酸進一步氧化生成β-酮己二酸，最后形成琥珀酸和CoA參與到TCA循環中；間位開環生成2-羥基己二烯半醛酸，開環產物分解為甲酸、乙醛和丙酮酸參與到TCA循環中［29］。

3 結論

a）正交實驗結果表明，在初始TPH含量10 000 mg/kg、C∶N∶P 100∶15∶1、土壤含水率20%、通風速率100 mL/min的條件下，生物修復63 d后，污染土壤中TPH的含量降低至3 167 mg/kg，降解率為68.3%；各因素對TPH降解率影響的大小順序為初始TPH含量＞土壤含水率＞C∶N∶P＞通風速率。

b）從碳骨架分析，生物通風修復后，脂肪族化合物的相對含量顯著降低，由修復前的27.9%降低至12.5%，脂環族化合物和芳香族化合物的相對含量有所增加，分別由修復前的52.5%和19.6%增加至61.3%和26.3%，表明脂肪族化合物比脂環族和芳香族化合物容易被降解，即具有開鏈碳結構的TPH比具有環狀碳結構的TPH更容易被微生物降解。

c）從TPH碳鏈的長短來看，生物通風修復后，C10～C16的相對含量明顯降低，由修復前的31.1%降低至16.7%，C17～C21和C22～C40的相對含量有所升高，分別由修復前的24.0%和44.9%升高至29.2%和54.2%，表明TPH的碳鏈越短越容易被微生物降解。

d）在適宜的條件下，微生物以TPH為碳源，在一系列酶的作用下，通過氧化、水解、烷基化和去烷基化等代謝方式將TPH逐步降解為CO2和H2O等，且TPH結構越簡單，越容易被降解。