Lsd1對小鼠調節性T細胞發育及活化的影響

夏妙然 周 航 王達祎 陳 萍

(首都醫科大學基礎醫學院免疫學系,北京 100069)

哺乳動物的免疫系統保護宿主免受病原微生物的侵害,但是過強的免疫反應,會導致自身免疫疾病,對宿主造成嚴重的損害。在哺乳動物體內,一些T細胞會積極抑制異?；蜻^度的免疫反應,這類細胞稱為調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)。Treg根據來源可分為兩類:①胸腺來源的Treg(thymus-derived Treg cells,tTreg),直接從胸腺CD4+T細胞分化而來[1];②外周來源的Treg(peripherally derived Treg cells,pTreg),由次級淋巴器官中的初始T細胞在TGF-β作用下經抗原刺激分化而來[2]。Treg在發育成熟后離開胸腺進入外周淋巴器官,成為靜息狀態的Treg(naive-like central Treg cell,cTreg),其特點為高表達歸巢型受體L-選擇素(CD62L)或CC趨化因子受體7(CC chemokine receptor 7, CCR7)。在抗原刺激下,cTreg可激活分化為活化狀態的效應Treg(activated effector Treg cell,eTreg),其CD62L表達下調,高表達激活性標志物CD44分子[3-4]。與cTreg相比,eTreg表達更高水平的Treg效應分子,如細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)和誘導性協同共刺激分子(inducible co-stimulatory molecule,ICOS),有助于增強其免疫抑制功能,對維持體內免疫平衡和免疫耐受發揮著重要作用[5]。

Treg的發育及功能行使依賴于叉頭框蛋白家族轉錄因子P3(forkhead box protein P3,Foxp3)的表達[6]。此外,已有報道揭示多種表觀遺傳調控分子在其譜系分化和維持中發揮重要作用,如NFAT[7]、NF-κB[8]和AML1[9]。Lsd1是第一個被發現的組蛋白去甲基化酶[10],其可以脫去組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)或第9位賴氨酸(H3K9)上的一甲基或二甲基化修飾,從而發揮抑制或增強基因表達的作用。Lsd1在許多惡性腫瘤中異常表達,如前列腺癌[11]、乳腺癌[12]、非小細胞肺癌[13]等。Lsd1被認為是多種癌癥的有效治療靶點[14],并且能增強免疫檢查點阻斷劑的抗腫瘤效果。最近的研究[15]表明,Lsd1也調控T細胞的發育及功能。在小鼠早期未成熟T細胞中敲除Lsd1,會引起胸腺中雙陽性T細胞(CD4+CD8+)及CD4單陽性T細胞減少。此外,在胸腺單陽性T細胞中敲除Lsd1,可以維持外周終末分化的殺傷性CD8+T細胞數量,從而促進結腸癌程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein-1,PD-1)抑制劑的免疫治療效果[16]。而Lsd1對Treg的發育及分化是否有調控作用,目前尚無系統性的證據。

本文研究通過將Lck-Cre工具鼠與Lsd1fl/fl小鼠雜交,繁育出在早期未成熟T細胞中特異性敲除Lsd1的小鼠(Lsd1fl/flLck-Cre)。通過流式細胞術檢測胸腺及外周免疫器官(脾、淋巴結)中Foxp3+Treg細胞的比例及數量,并分析其中eTreg/cTreg的比例,來探究Lsd1對Treg發育及活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Lsd1fl/fl小鼠和Lck-Cre小鼠由首都醫科大學地壇醫院傳染病研究所王璽教授課題組惠贈。Lsd1fl/fl小鼠是在Lsd1基因5號和6號外顯子兩側插入floxp序列的C57BL/6背景小鼠[17],Lck-Cre小鼠是Lck基因啟動子驅動Cre酶表達的C57BL/6背景小鼠[18]。將成年Lsd1fl/fl小鼠和Lck-Cre小鼠連續雜交篩選,獲得在早期CD4-CD8-T細胞中特異性敲除Lsd1的小鼠(Lsd1fl/flLck-Cre,KO),將同窩非敲除小鼠作為對照組小鼠(control,Ctrl),選取6～8周齡小鼠用于實驗。小鼠飼養于首都醫科大學實驗動物部動物飼養室,所有操作均經過首都醫科大學動物實驗與實驗動物管理委員會審查批準(批準文號:AEEI-2023-084)。實驗動物使用許可證號: SYXK(京)2018-0003。

1.2 主要試劑

CD4 monoclonal antibody-Alexa Fluor700(56-0042-82)購自美國eBioscince公司,Ghost Dye Violet 510(13-0870-T100)、Purified anti-mouse CD16/CD32(70-0161-U500)、RBC lysis buffer(TNB-4300-L100)、Foxp3/Transcription factor staining buffer kit(TNB-0607)均購自美國Tonbo Biosciences公司,PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse CD8a(551162)、FITC rat anti-mouse CD44(553133)購自美國BD Biosciences公司, Brilliant Violet 421 anti-mouse CD62L antibody(104436)、PE anti-mouse Foxp3 antibody(126404)購自美國Biolegend公司。Histone H3 antibody(9715)、LSD1 antibody(2139)購自美國CST公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠基因型鑒定

剪取3周齡新生鼠鼠尾(2～4 mm)加入75 μL堿液(25 mmol/L NaOH,0.2 mmol/L EDTA),99 ℃加熱30 min裂解。每管加入75 μL酸液(40 mmol/L Tris-HCl)中和,混勻,即獲得小鼠DNA。以此為模板,分別使用針對Lsd1基因floxp位點引物及針對Lck-Cre基因引物(表1)進行多重聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction, PCR)擴增,擴增產物使用1.5%(質量分數)的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.2 蛋白印跡(Western blotting)

分別取6～8周齡對照組和敲除組小鼠,處死后分離胸腺,在200目篩網研磨,制備成單細胞懸液,加入紅細胞裂解液室溫下裂解5 min,使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌,300g離心7 min。棄掉上清,用Buffer A[10 mmol/L HEPES pH 7.9,10 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,0.34 mol/L Sucrose,10% (體積分數)Glycerol,1 mmol/L DTT,0.1%(體積分數)Triton X-100]重懸,冰上放置5 min,然后4 ℃ 1300g離心4 min,沉淀為細胞核,用蛋白上樣緩沖液重懸細胞核,超聲至溶液不再黏稠,置于金屬浴95 ℃煮5 min。配制12%(質量分數)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyac-rylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠,之后進行電泳、轉膜、5%(質量分數)脫脂奶粉封閉。用H3和Lsd1一抗4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液(tris-buffered saline tween-20)洗膜3次,兔二抗室溫孵育1 h,TBST再次洗膜3次,使用Amersham Image Quant 800曝光分析。

1.3.3 淋巴器官指數測定

稱量小鼠體質量,采取頸椎脫臼法處死小鼠。取腹股溝淋巴結及腋窩下淋巴結后,打開小鼠胸腔取出胸腺,打開腹腔取出脾,在PBS緩沖液中清洗,置于吸水紙上吸干水分,電子天平稱質量。免疫器官指數按以下公式計算:臟器指數=臟器質量(mg)/動物體質量(g)。

1.3.4 流式細胞術

選取 6～8 周齡的對照組和敲除組小鼠各3只,分離胸腺、脾和淋巴結,在200目篩網研磨,分別制備成單細胞懸液,紅細胞裂解液室溫裂解5 min,PBS洗滌并計數。每只小鼠分別取2×106個細胞進行染色。先使用Ghost Dye Violet 510染料室溫避光染色15 min,用以區分死細胞,洗滌后加入Anti-Mouse CD16/CD32封閉,4 ℃避光孵育5 min。隨后加入抗體(anti-CD4、anti-CD8、anti-CD62L、anti-CD44),室溫避光染色15 min,洗滌2次。用商品化試劑Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit進行固定及打孔,加入PE anti-mouse Foxp3抗體,室溫避光孵育45 min,洗滌、重懸后使用BD Fortessa流式細胞儀進行分析,分析并統計每只小鼠的流式結果。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠基因型鑒定

每只小鼠分別用針對Lck-Cre基因和Lsd1基因的引物進行檢測。對于Lck-Cre基因,在350 bp處出現明顯條帶的為陽性(圖1A中2、3、4、5號)。帶有floxp位點的等位基因擴增產物條帶位于169 bp(Lsd1-fl),不帶有floxp位點的等位基因擴增產物位于136 bp(Lsd1-wt);故圖中1號、3號Lsd1基因型為Lsd1fl/wt,2號、4號為Lsd1wt/wt,5號為Lsd1fl/fl。綜合兩個基因鑒定結果,圖1中5號小鼠為敲除組小鼠,基因型為Lsd1fl/flLck-Cre。Lck啟動子誘導的Cre酶可在胸腺未成熟雙陰性(CD4-CD8-)T細胞中特異性表達[18],切割帶有floxp位點的Lsd1基因序列,從而獲得在未成熟T細胞中特異性敲除Lsd1的小鼠。筆者利用Western blotting實驗檢測了對照組和敲除組小鼠胸腺細胞中Lsd1的表達量(圖1B),在敲除組小鼠胸腺細胞中幾乎檢測不到Lsd1的表達。

圖1 小鼠基因型鑒定及Lsd1表達水平檢測Fig.1 Genotype identification of mice and detection of Lsd1 expression level

2.2 敲除T細胞中Lsd1使小鼠胸腺萎縮

取敲除組小鼠和同窩對照小鼠各三只,取每只小鼠的胸腺、脾及腹股溝和腋窩下淋巴結,稱質量并拍照。與對照組相比,敲除組小鼠的胸腺明顯萎縮(圖2A),而其脾及淋巴結的大小(圖2A)無明顯區別。敲除組小鼠胸腺指數降低,但組間差異無統計學意義(P>0.05),胸腺細胞總數較對照組顯著降低(圖2B)。兩組小鼠脾、淋巴結的質量及細胞數差異無統計學意義(圖2C、2D)。以上結果說明在未成熟T細胞中特異性敲除Lsd1可導致小鼠胸腺萎縮,但不影響外周免疫器官(脾、淋巴結)的細胞總數。

圖2 Lsd1敲除對胸腺、脾及淋巴結質量和細胞數的影響Fig.2 Effect of Lsd1 knockout on weight and cell numbers of thymus, spleen, and lymph nodes

2.3 敲除T細胞中Lsd1后小鼠胸腺中Treg的比例和數量明顯增加

采用流式細胞術分析對照組及敲除組小鼠胸腺細胞亞群(圖3A),結果顯示,與對照組相比,CD8單陽性T細胞數量有輕微下降但差異無統計學意義(P>0.05),而CD4單陽性T細胞數量顯著下降(P<0.05)(圖3B)。但敲除組小鼠胸腺Foxp3+Treg占CD4單陽性T細胞亞群的比例明顯上升(P<0.05)(圖3C),且占總胸腺細胞數的比例及絕對數也顯著增加(P<0.05)(圖3D)。這提示在胸腺早期T細胞中特異性敲除Lsd1促進了CD4+T細胞向Treg方向的發育。

圖3 小鼠胸腺T細胞亞群分析Fig.3 Analysis of thymic T cell subsets of mice

2.4 Lsd1敲除后小鼠外周eTreg的比例明顯增加

提取敲除組和對照組小鼠脾和淋巴結中的淋巴細胞,通過流式細胞術檢測,與對照組相比,敲除組脾(圖4A)和淋巴結(圖4B)CD4+T細胞的比例明顯減少(P<0.05)。Treg占CD4+T細胞的比例仍然升高,但升高幅度不及胸腺Treg,絕對數差異無統計學意義(P>0.05)(圖4C、4D)。以CD44及CD62L作為標志物,敲除組小鼠脾及淋巴結中eTreg(CD44+CD62Llo)的比例增加,cTreg(CD44loCD62L+)的比例降低,eTreg/cTreg比例顯著上升(P<0.05)(圖5A、5B)。不僅如此,對于脾及淋巴結中的cTreg亞群,其在Lsd1敲除后表達激活性分子CD44水平也顯著升高(P<0.05),而表達CD62L水平顯著降低(P<0.05)(圖5C、5D)。以上結果提示敲除T細胞中的Lsd1能夠促進小鼠脾和淋巴結中Treg的激活。

圖4 小鼠脾和淋巴結中Treg分析Fig.4 Analysis of Treg in mouse spleen and lymph nodes

圖5 小鼠脾和淋巴結中eTreg/cTreg分析Fig.5 Analysis of eTreg/cTreg in mouse spleen and lymph nodes

3 討論

在本研究中,在早期胸腺T細胞中敲除組蛋白去甲基化酶Lsd1后,小鼠胸腺明顯萎縮、細胞數顯著減少。雖然外周免疫器官(脾臟、淋巴結)細胞數無明顯差異,但其中T細胞比例及數量均顯著降低。以上提示Lsd1在維持正常T細胞發育及數量的過程中發揮著至關重要的作用。在一項利用Cd2-Cre工具酶敲除Lsd1的研究[15]中,也發現了類似的胸腺及外周的Treg數量減少的現象。在本文研究中,雖然胸腺中CD4+T細胞數量下降明顯,但Treg比例及細胞數卻顯著上升,這提示Lsd1的敲除促進了CD4+T細胞向Treg方向的分化。報道[15]顯示,Lsd1敲除后,胸腺細胞中干擾素通路上調,外周淋巴結CD8+T細胞呈現天然記憶(innate-memory)狀態,胸腺及外周的Treg表面免疫檢查點受體(PD-1、CTLA-4、Nrp1等)表達升高。筆者推測,這種在未成熟階段過早活化的狀態,有可能導致T細胞反饋性上調抑制性分子的表達并促進抑制性Treg細胞的生成。但Lsd1如何調控這一通路并影響T細胞發育,還有待研究。

在敲除組小鼠的外周免疫器官,Treg占CD4+T細胞比例同樣顯著升高。但由于在胸腺萎縮的情況下,外周的Treg數量也顯著減少,最終計算出外周脾及淋巴結Treg的絕對數差異無統計學意義。在生理狀態下,Treg在抗原刺激后向eTreg方向分化[19]。本文研究中,敲除組小鼠的外周eTreg比例顯著升高,cTreg的比例顯著降低,且cTreg表面激活性受體CD44的表達水平也顯著升高,提示其也正在向激活狀態轉化,這可能也與上文中提及的過早激活的干擾素信號有關。此外,eTreg的增殖及歸巢能力均低于cTreg[3],且cTreg本身歸巢受體CD62L表達水平顯著降低,這也可能是外周免疫器官中Treg細胞數沒有明顯升高的原因之一。

在Treg細胞分化發育過程中,轉錄因子Foxp3是必不可少的。值得一提的是,有文獻[20]報道,Foxp3能夠招募CoREST復合體抑制Treg中IFN-γ及IL-2等靶基因的轉錄。CoREST復合體由核心組分Rcor1及組蛋白去乙?；窰dac1/2和組蛋白去甲基化酶Lsd1共同構成[21]。在Treg中特異性敲除CoREST復合體核心組分Rcor1會損害Treg細胞功能,外周淋巴組織中Treg比例有微弱的數量減少,且Treg分泌IFN-γ及IL-2增多。在此報道[20]中,Rcor1敲除后胸腺Treg細胞比例不受影響,其外周Treg的激活也變化不大。雖然同樣也是CoREST復合體的組成成分之一,在本文研究中,Lsd1條件性敲除對Treg的影響更大。一方面,這可能是由于該研究[20]中僅用Foxp3-Cre工具酶在Treg細胞中進行基因敲除,而本文實驗中敲除Lsd1的階段更早,因此對其分化發育影響更大。另一方面,這也提示Lsd1還參與調控其他的通路和靶基因。

Treg在建立并維持機體的免疫穩態過程中發揮著關鍵作用[22]。其主要通過直接接觸或分泌TGF-β、IL-10等細胞因子的方式負調控免疫應答[22]。Treg的缺失及功能低下與多種自身免疫性疾病相關。本文研究表明抑制Lsd1有助于促進Treg的發育及活化。有研究[23]發現CD4+T細胞中敲除Lsd1能抑制細胞功能并改善類風濕性關節炎小鼠模型的嚴重程度。當前,Lsd1抑制劑在腫瘤治療中的應用已有廣泛研究[14],本文研究提示其在自身免疫病的治療中也具有潛在的應用價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明夏妙然、周航:負責實驗設計與操作,撰寫與修改論文;王達祎:參與實驗操作;陳萍:修改與審定論文。