群體基因組分析揭示短耳犬蝠適應城市化的遺傳學基礎

王菲 趙華斌

（武漢大學生命科學學院，武漢 430072）

隨著人類社會的發展，人類活動深刻地影響了地球生態環境，成為一種足以與自然力量相匹配的影響因素 (Crutzen, 2002)。這種由人類活動主導的地質時代被稱為人類世 (Anthropocene) (Dirzoet al., 2014; Vidler, 2021)。在全新世一萬多年的時間內，全球平均氣溫一直相當穩定，但在過去短短的一百年里全球平均氣溫上升了1 ℃ (Glikson,2016)，說明人類活動對地球生態環境產生了巨大影響。人類世開始的時間眾說紛紜，但由于人類經濟活動在1945—1955 年呈指數增長，1945 年是一個得到廣泛認可的時間點 (Corlett, 2015)?？焖俪鞘谢钱敶祟愂赖囊粋€顯著特征 (Munshi-Southet al., 2016)。城市化改變了自然生態系統，如農田被住宅代替、湖泊被泥土填埋以及森林被砍伐進而導致生境破碎化，還有工業廢氣和汽車尾氣無節制排放導致熱島效應的產生等等 (Harris and Munshi-South, 2017)。這一系列破壞自然環境的行為對生物多樣性和各物種的種群規模都造成一定沖擊(Fahrig, 2003; Dirzoet al., 2014)；有研究發現，城市中的鳥類群落相較于農村稀有物種更少、物種豐富度更低 (Senguptaet al., 2014)。

蝙蝠是城市中最多樣的哺乳動物類群之一 (Vitouseket al., 1997; Jung and Kalko, 2011)，雖然在城市中分布廣泛，但其物種豐富度卻隨著城市化程度加深而減少 (Gaisleret al., 1998)。因此，城市化是蝙蝠面臨的主要威脅之一 (Fricket al., 2020)。當生活在城市中的蝙蝠食用了接觸過農藥的水果或飲用受污染的水后，其免疫系統和身體機能可能會受到影響 (Bayatet al., 2014)；同時，蝙蝠的一些生活習性讓其對城市化引起的棲息地擾動特別敏感，由于蝙蝠是夜行性動物，夜晚道路的人工照明加劇了道路的屏障效應，對許多飛行緩慢的蝙蝠造成了阻礙，縮小了其活動范圍 (Stoneet al., 2009)；另外一些依靠回聲定位捕食的蝙蝠可能由于道路上的各種交通噪聲干擾其低頻聲波，進而影響其捕食效率 (Siemers and Schaub, 2011)(圖1)。早期關于城市化對蝙蝠影響的相關研究主要集中在行為學和生態學方面，關注蝙蝠適應城市化的遺傳機制研究則相對較少。短耳犬蝠(Cynopterus brachyotis) 是城市中較為常見的蝙蝠，隸屬于狐蝠科 (Pteropodidae) 犬蝠屬 (Cynopterus)，廣泛分布在南亞、東南亞等熱帶地區，以水果、花蜜和多種植物花粉為食，常棲息在城市的次生林或農地的光線陰暗處，有助于傳播本地植物種子、保護植物景觀，在生態系統中扮演著重要角色 (Chanet al., 2021)。然而，隨著城市化日益加劇，短耳犬蝠的棲息環境發生了巨大變化，這可能會對其生存產生一定影響。以發生快速城市化的新加坡為例，近期的研究表明，隨著人類活動增加，1931—2012 年短耳犬蝠的遺傳多樣性呈明顯的持續下降趨勢 (Chattopadhyayet al., 2019)。然而，該研究并沒有探究與城市化相關的遺傳學基礎。因此，本研究旨在通過分析短耳犬蝠的歷史和當代群體的基因組數據，解析基因組中的選擇信號，進而探究城市化對蝙蝠的影響及蝙蝠適應城市化的遺傳學基礎。

圖1 對蝙蝠產生影響的城市化因素 (蝙蝠剪影來源于phylopic.org)Fig. 1 Urbanization factors affecting bats (Bat silhouettes were taken from phylopic.org)

1 研究方法

1.1 數據來源

本研究對象為新加坡的短耳犬蝠，使用的41個蝙蝠個體的基因組序列數據來自Chattopadhyay等 (2019) 發表的文章。全部個體均來自新加坡，無明顯的群體結構 (Chattopadhyayet al., 2019)。其中21 個樣本采集于1931 年，構成本研究中的歷史樣本數據集；另外20 個樣本采集于2011—2012年，構成當代樣本數據集。

1.2 數據質控、比對、突變位點的識別

先使用fastp (Chenet al., 2018) 去除原始數據中低質量的序列，再使用FastUniq (Xuet al.,2012) 去除序列中的PCR 重復。過濾后的序列與短耳 犬 蝠 的 參 考 基 因 組 (GenBank 編 號SSHV00000000) 通過 Burrows-Wheeler Aligner(BWA) 的BWA-MEN 命令進行比對，得到Sequence Alignment/Map Format (SAM) 格式文件。使用Samtools (Liet al., 2009) 中的sort 命令將SAM文件轉換為二進制的BAM 文件，然后使用bcftools (Liet al., 2009) 對BAM 文件進行單核苷酸多態性分析 (SNP calling)，得到存儲單核苷酸多態性信息的Variant Call Format (VCF) 格式文件。

1.3 選擇信號分析

1.3.1 位點突變頻率方法

單核苷酸多樣性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 通過堿基的轉換、顛換、插入、缺失引起DNA 序列發生改變，這些改變可能會導致DNA 序列翻譯出的氨基酸與之前不同。氨基酸發生改變的核苷酸變異為非同義突變，反之則為同義突變?；虻姆峭x突變可能會不同程度地影響蛋白質的結構和功能，長期以來都是進化遺傳學研究的重點內容。本研究利用短耳犬蝠基因組的General Feature Format (GFF) 文件對得到的VCF文件進行注釋，篩選出發生非同義替換的位點信息。分別計算歷史樣本數據集、當代樣本數據集中非同義替換位點的突變頻率 (f歷史，f當代)。如果(f歷史- f當代) ＞ 0.8 或 (f歷史/ f當代) ＞ 2，則認為，相較于當代樣本，該基因在歷史樣本中有顯著高的突變頻率；如果 (f當代- f歷史) ＞ 0.8 或 (f當代/ f歷史) ＞ 2，則認為，相較于歷史樣本，該基因在當代樣本中有顯著高的突變頻率 (Zhanget al., 2020)。

1.3.2 基于群體遺傳分化的選擇信號檢測方法

群體間遺傳分化指數 (fixation index, Fst) 和核苷酸多樣性 (π) 已被證實是評估選擇信號的有效方法。Fst 越大，提示種群間的遺傳差異越大；π 數值越大，說明種群內的核苷酸多樣性越高 (Weir and Cockerham, 1984)。本研究將二者結合使用，將過濾后總樣本數據集的VCF 文件利用vcftools(Daneceket al., 2011) 計算短耳犬蝠歷史樣本數據集、當代樣本數據集之間的Fst 值 (滑動窗口長度為50 kb)，同時分別計算短耳犬蝠歷史樣本數據集、當代樣本數據集的π 值 (滑動窗口長度為50 kb)。Fst 數值最高的5%和log2(π1/π2) 數值最低的5%區域的交集為歷史樣本受選擇基因區域，Fst數值最高的5%和log2(π1/π2) 數值最高的5%區域的交集為當代樣本受選擇基因區域 (Qiuet al., 2015;Chenet al., 2016)。

1.3.3 基于單倍型的選擇信號檢測方法

群體間擴展單倍型純合度 (cross population extended haplotype homozogysity, XP-EHH) 是常用的比較兩個群體之間的選擇信號檢測方法。本研究使用SELSCAN 軟件進行計算 (Szpiech and Hernandez, 2014)，將短耳犬蝠當代樣本數據集作為目標群體，歷史樣本數據集作為參考群體。當位點的XP-EHH 值為正，表明在目標群體受選擇，當該值為負則代表在參考群體中受選擇。對得到的所有結果按XP-EHH值從高到低進行排序，取數值最高的1%區域 (且為正值) 為當代樣本受選擇區域，取數值最低的1%區域 (且為負值) 為歷史樣本受選擇區域 (Sabetiet al., 2007)。

1.3.4 受選擇基因座檢測方法

提取41 個樣本中發生非同義替換的堿基序列作為輸入文件，按樣本采集時間分為歷史樣本、當代樣本兩個數據集。使用Arlequin 軟件 (Excoffier and Lischer, 2010) 中的“Detecting loci under selection”功能檢測在歷史、當代種群中受選擇的基因位點。

1.4 基因功能注釋和富集

利用BLASTP 程序 (Sheet al., 2011)，E 值設定為 ＜ 10-10；將短耳犬蝠的蛋白質序列和人類蛋白質數據庫中的序列進行比對，注釋出短耳犬蝠的基因功能。通過Metascape (https://metascape. org)(Zhouet al., 2019) 在線數據庫對選擇信號分析中得到的受選擇基因進行富集分析，富集通路的功能分類參考了Gene Ontology (GO) (Ashburneret al., 2000)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Kanehisa and Goto, 2000)、Reactome數據庫 (Fabregatet al., 2017)。

2 結果

2.1 受選擇基因檢測

在基于群體遺傳分化的選擇信號檢測方法中，通過計算Fst、π 值在歷史樣本找到了16 個受選擇基因，在當代樣本找到了6 個受選擇基因；基于單倍型的選擇信號檢測方法，通過計算XP-EHH值在歷史樣本中鑒定出85 個基因，在當代樣本中鑒定出611 個基因；基于比較位點突變頻率的方法，在歷史和當代樣本中分別發現了240個和1 053 個受選擇基因；基于Arlequin檢測樣本基因序列受選擇基因座的方法，在歷史樣本中檢測到413 個基因，在當代樣本中檢測到954 個基因 (圖2)。由于基于群體遺傳分化的選擇信號檢測方法得到的基因數目較少，后續討論均基于其余3種方法。

圖2 短耳犬蝠受選擇基因數量Fig. 2 Numbers of positively selected genes in Cynopterus brachyotis

2.2 短耳犬蝠歷史樣本受選擇基因的富集結果

短耳犬蝠歷史樣本的基因功能富集結果中有4 條視覺相關的通路，包括眼的形態發生 (GO:0048592)、探測可見光 (GO: 0009584)、眼的發育(GO: 0043010) 和眼的視網膜發育 (GO: 0060041)；1 條嗅覺相關的通路：嗅覺感知 (GO: 0007608)。使用Arlequin方法也同樣富集到了與視覺、嗅覺相關的通路：視黃醇循環 (R-HSA-2453902)、視黃醇新陳代謝 (hsa00830)、 視覺光傳導 (R-HSA-2187338) 和與化學刺激檢測相關的嗅覺感知 (GO:0050911) (圖3)。

圖3 短耳犬蝠歷史樣本 (1931年) 受選擇基因GO、KEGG和Reactome通路富集結果 (P ＜ 0.05). 黃色表示使用頻率比得到的富集通路，綠色表示使用Arlequin得到的富集通路Fig. 3 Functional enrichment analysis of GO terms, KEGG and Reactome pathways for positively selected genes in historical samples (sample from 1931) of the fruit bat (P ＜ 0.05), with yellow representing pathways identified using the frequency ratio method, and green indicating pathways identified using Arlequin

2.3 短耳犬蝠當代樣本受選擇基因的富集結果

對短耳犬蝠當代樣本進行富集分析的結果顯示，3 種方法一共發現了26 條與免疫相關的通路，包括：T 細胞的選擇 (GO: 0045058)、正調控白細胞分化 (GO: 1902107)、病毒生命周期的負調控(GO: 1903901)、病毒進入宿主細胞的負調控 (GO:0046597) 等 (圖4)。這些通路包含了ⅠL2RA、ⅠL10、C2、C3AR1、STAT6、GSDMA、NLRP10等重要的免疫基因。在當代樣本中，還發現了味覺傳導(hsa04742)、酸味感知 (GO: 0050915) 和苦味感知(GO: 0050913) 3 個與味覺相關的通路，包括ⅠTPR3、PⅠGR、TAS2R5、TAS2R4、RTP4、RTP1、SCNN1A、PKD2L1、PKD1L3、TAS1R2等基因 (圖4)。其中TAS2R4和TAS2R5是Ⅱ型味覺受體基因(Tas2r) 家族成員，功能是感知苦味化合物 (Bachmano and Beauchamp, 2007)。此外，我們還發現了與聽覺相關的通路耳蝸外毛細胞對聲音的感知 (RHSA-9662361)。

圖4 短耳犬蝠當代樣本 (2011—2012年) 受選擇基因GO、KEGG和Reactome通路富集結果 (P ＜ 0.05). 黃色表示使用頻率比得到的富集通路，藍色表示使用XP-EHH得到的富集通路，綠色表示使用Arlequin得到的富集通路Fig. 4 Functional enrichment analysis of GO terms, KEGG and Reactome pathways for genes in contemporary samples (sample from 2011 -2012) of the fruit bat (P ＜ 0.05), with yellow representing pathways identified using the frequency ratio method, blue representing pathways identified using XP-EHH, and green indicating pathways identified using Arlequin

3 討論

本研究通過分析短耳犬蝠的群體基因組數據，在歷史樣本和當代樣本中都找到了與嗅覺、視覺相關的受選擇基因 (圖3，圖4)。與歷史樣本相比，在當代樣本中發現了與免疫、聽覺、味覺相關的受選擇通路 (圖4)，提示蝙蝠適應城市化可能在免疫應答、捕獵定位、感知食物方面發生了適應性的分子進化。

城市化改變了自然環境，工廠、住宅、商鋪的興建產生大量污水和垃圾對環境造成污染。有研究表明，環境污染物可能會損害生物的免疫系統，誘導機體產生免疫毒性 (Suzukiet al., 2020)。在短耳犬蝠當代樣本的受選擇基因富集結果中，本研究發現了較多與免疫相關的通路，其中在通路T 細胞的選擇 (GO: 0045058) 中包含基因STAT6。免疫通路信號分子STAT6可以介導白細胞介素-4(ⅠL-4) 的表達，在淋巴瘤、哮喘、過敏性疾病等病理中起著重要作用 (Danielet al., 2000)；在正調控白細胞分化 (GO: 1902107) 和與炎癥反應相關的傷口愈合 (GO: 0002246) 通路中，我們也發現了與白細胞介素相關的基因ⅠL2RA、ⅠL10、ⅠL1A。上述基因的突變可能使特異性疾病的易感性升高 (Danielet al., 2000)。同時，我們還發現了病毒生命周期的負調控 (GO: 1903901) 和病毒進入宿主細胞的負調控 (GO: 0046597) 兩個與機體抗病毒免疫應答相關的通路。除此之外，我們也對非編碼區的突變進行了選擇信號分析，在富集結果中同樣找到了T細胞外滲的調控 (GO: 2000407)、病毒感染途徑(R-HSA-9824446)、白細胞介素-2 產生的正向調節(GO: 0032743) 等多條與免疫相關的通路。因此，本研究做出推測：城市建設過程中產生的環境污染對短耳犬蝠的免疫系統可能產生了一定的影響，使其免疫力下降；同時城市化帶來的新生境可能讓蝙蝠暴露于更多病原體中，更容易受到病原體的攻擊。當代樣本中還有一條值得關注的通路：利什曼原蟲的生長和存活 (R-HSA-9664433)。利什曼原蟲主要寄生在宿主的肝臟、脾臟、淋巴結等器官的巨噬細胞，是一種可以引起黑熱病的寄生蟲 (Hemet al., 2011)。有研究發現，建筑物是多種寄生蟲產卵和發育的溫床，棲息在建筑物中的蝙蝠容易攜帶更多寄生蟲 (Pattersonet al., 2007)。另外，雌性蝙蝠在懷孕期間可能會受到一定程度的免疫抑制，它們在此過程中可能遭受嚴重的寄生蟲感染 (Schneebergeret al., 2013; Lilleyet al.,2014)。這些原因可能會導致棲息在城市環境中的蝙蝠具有更高的感染寄生蟲的風險。

蝙蝠一般通過視覺、嗅覺、味覺、回聲定位等多種感覺系統協助來覓食 (Korine and Kalko,2005; Zhaoet al., 2009; Page and ter Hofstede,2021)。然而，短耳犬蝠無回聲定位系統，其主要依賴視覺和嗅覺來尋找食物。視覺和嗅覺通路同時出現在短耳犬蝠歷史和當代樣本的富集結果中，暗示這兩種感覺系統對短耳犬蝠覓食起重要作用。聽覺和味覺相關的通路在本研究只出現在當代樣本的富集結果中。一些蝙蝠通過傾聽獵物發出的聲音，例如翅膀運動、交配叫聲等來進行定位和捕獲 (Page and ter Hofstede, 2021)。模擬的交通噪音可以降低大鼠耳蝠 (Myotis myotis) 的攝食效率(Siemers and Schaub, 2011)。因此，我們推測在當代樣本中富集的聽覺相關通路基因可能與短耳犬蝠需要適應城市化帶來的各種噪音污染有關。另外，味覺可以使動物感知食物中的營養物質和有害物質，對動物選擇食物至關重要 (Bachmano and Beauchamp, 2007)。味覺相關的受選擇基因包括TAS2R4、TAS2R5兩個苦味受體基因；許多有毒有害物質都具有苦味，苦味受體基因對苦味物質的感知可以使動物避免攝入有害物質 (DeSimoneet al., 2001)。有研究表明，人類的TAS2R4可以感知苯甲地那銨 (Denatonium benzoate)、秋水仙堿(Colchicine)、苦參素 (Quassin) (Meyerhofet al.,2010)；苯甲地那銨可以作為厭惡劑添加到塑料橡膠玩具、防凍劑和家用清潔劑中防止誤食，也會作為驅蟲物質被添加到某些農藥、殺蟲劑中(Spannet al., 2000)；秋水仙堿和苦參素可以用作殺蟲劑。人類活動可能使上述物質在環境中的含量增多，更易被蝙蝠攝入，進而使蝙蝠的苦味受體基因在當代樣本中受到較強的選擇壓力。

在人類世，城市化不可避免地對蝙蝠等野生動物帶來了巨大的負面影響，使它們在城市中的生存面臨挑戰 (Fahrig, 2003)。如何協調人類與自然環境的關系？尤其是在兼顧自身發展的同時保護生物多樣性是人類可持續發展面臨的重要挑戰。本研究通過群體基因組數據檢測了短耳犬蝠基因組中與城市化相關的選擇信號，初步討論了快速城市化給其帶來的潛在風險，進而探究了蝙蝠適應城市化的遺傳學基礎。本研究提示，城市化可能影響蝙蝠的免疫系統，并干擾蝙蝠的聽覺和味覺等感覺系統，同時蝙蝠可能產生快速的適應性分子進化以應對快速改變的城市生態環境。