高溫暴露對黑線倉鼠能量代謝和組織氧化應激的影響

張銳涵 羅丹 羅欣欣 胡陳曉 林瓏 陳倩 曹靜 趙志軍

（溫州大學生命與環境科學學院，浙江省水環境與海洋生物資源保護重點實驗室，溫州 325035）

小型哺乳動物能量代謝的適應性調節是其應對環境的重要生理學和行為學策略之一，對增強其適應能力，提高生存機會具有重要意義 (王德華，2011; Liuet al., 2013; Zhanget al., 2018)。動物的代謝水平影響其地理分布、生長、發育、繁殖、衰老等很多生活史特征。生命的速度假說(the rate of living theory, ROL) 認為，壽命的長短與代謝率的高低有關，代謝率越低的動物壽命越長。例如與體型較小的物種相比，體型較大的物種通常代謝率較低 (單位體重的代謝率)，壽命較長。但是鳥類在靜止和活動時均具有較高的代謝率，飛翔時機體最耗能 (Wardet al., 2004)，然而壽命卻長于相同體型的哺乳動物 (Holmeset al., 2001; Furness and Speakman, 2008)。在哺乳動物中，蝙蝠的代謝水平較高，壽命較長 (Brunet-Rossinni and Austad, 2004)，而有袋類動物的代謝率較低，壽命卻低于真哺乳亞綱類動物 (Speakman and Selman,2011)。這些研究結果不支持ROL 假說。而自由基假說 (the freeradical hypothesis) 認為，不同代謝水平條件下，組織產生的自由基水平不同，造成的氧化損傷存在差異，是影響衰老和壽命的關鍵，例如雖然鳥類的代謝水平較高，但機體產生的自由基水平較低，因此壽命較長 (Barja and Herrero,1998; Pamplonaet al., 2005)，故此自由基假說解釋了ROL假說不能解釋的現象。

自由基是細胞代謝過程中產生的活性物質，能夠誘發一系列的氧化反應，被認為是細胞內能量代謝的副產物，其水平與代謝率的變化有關(Speakman and Selman, 2011)。正常情況下組織中抗氧化酶組成的機體抗氧化防御系統包括超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-Px)、過氧化氫酶等會及時清除自由基。但在代謝率發生顯著變化時，自由基產生的速率可能大于抗氧化防御能力，導致氧化應激，造成組織脂質、蛋白乃至核酸的氧化損傷 (Sohal, 2002; Speakmanet al.,2004; Selmanet al., 2013)。組織的自由基水平和氧化損傷與線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化偶聯程度有關，例如對果蠅 (Drosophila melanogaster) 研究發現，增加線粒體呼吸率和解偶聯蛋白 (uncoupling protein, UCP) 的表達水平，顯著降低了自由基生成速率，果蠅的壽命延長 (Fridellet al., 2005)。適度增加線粒體氧化磷酸化解偶聯，可以降低自由基水平 (Echtayet al., 2002; Padalko, 2005)。對小鼠的研究發現，具有較高代謝率的個體，壽命較長，肌肉解偶聯蛋白介導線粒體質子漏也較高，自由基水平較低 (Speakmanet al., 2004)。然而低溫暴露大鼠 (Rattus norvegicus) 的代謝率顯著增加，但與此同時，肝臟、心臟和骨骼肌的自由基水平升高，氧化損傷顯著增加 (Vendittiet al., 2004)。由此可見，機體代謝率、組織線粒體呼吸率與氧化磷酸化偶聯程度都是影響自由基生成速率的重要因素 (Balabanet al., 2005)，但上述研究結果并不完全一致。

在自然環境因子中，溫度對能量代謝的影響尤為突出。動物一般通過增加能量攝入和代謝產熱以應對低溫環境 (王德華，2011; Xinget al.,2015, 2016; Xuet al., 2019a, 2019b)。隨全球氣候變暖，高溫熱浪發生的頻率日益增加。季節性環境溫度升高，特別是在環境溫度接近甚至高于體溫的條件下，動物體溫和環境溫度差距變小，機體的熱傳導率降低，散熱愈加困難 (Zhaoet al.,2020)。在高溫環境下，小型哺乳動物增加散熱以維持恒定體溫，與此同時代謝率也顯著升高。然而動物在低溫和高溫的環境下，代謝率均顯著增加，線粒體氧化磷酸化解偶聯程度的變化卻不盡相同。低溫下動物褐色脂肪組織 (brown adipose tissue, BAT)、肝臟、骨骼肌等組織線粒體呼吸率顯著增加，解偶聯蛋白基因和蛋白表達水平顯著上調，氧化磷酸化解偶聯程度顯著增加 (Jastrochet al., 2007; Zhanget al., 2012)，而高溫下代謝率顯著增加，組織解偶聯蛋白表達水平卻顯著降低，氧化磷酸化解偶聯程度顯著降低 (Trayhurnet al.,1987; Hulbertet al., 2002)。因此在高溫馴化 (暴露) 條件下研究動物代謝率、組織呼吸率及自由基水平的關系，可進一步檢驗自由基假說，但相關研究尚未見報道。

黑線倉鼠 (Cricetulus barabensis)，屬嚙齒目倉鼠科倉鼠亞科倉鼠屬，廣泛分布于我國東北和華北地區的農田和草原，棲息地氣候具有顯著季節性變化 (霍達亮等，2022)。黑線倉鼠不冬眠，冬季低溫環境下代謝率顯著增加 (Zhaoet al., 2010；畢中強等，2018)。低溫暴露影響黑線倉鼠肝臟、心臟、腎臟和肌肉等主要組織器官的自由基水平；不同器官或組織自由基水平不同 (Chenet al.,2014；陳可新等，2015)；代謝率與BAT 自由基水平可能存在負相關關系，BAT 的UCP1 可能在降低自由基生成方面發揮重要作用。為了探討高溫環境下能量代謝及主要代謝活性器官組織呼吸率、自由基水平和抗氧化能力的內在聯系，研究機體在代謝率降低的條件下，肝臟、心臟、肺臟、腎臟、腦及肌肉氧化應激和氧化損傷的變化，我們將室溫 (21 ℃) 和暖溫 (32.5 ℃) 馴化的黑線倉鼠分別急性高溫暴露 (37 ℃)，測定代謝率，以及BAT、肝臟和肌肉的線粒體呼吸率，ucp基因表達，蛋白羰基和丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 水平，以及SOD 和GSH-Px活性。我們假設急性高溫暴露使黑線倉鼠代謝率顯著增加，但是線粒體呼吸率、解偶聯蛋白基因表達降低可能導致自由基水平升高，研究結果支持自由基假說。

1 研究方法

1.1 實驗動物

實驗用黑線倉鼠為野生個體的繁殖后代，飼養于溫州大學動物氣候室，溫度為 (21 ± 1) ℃，光照為12L∶12D (08: 00—20: 00 光照)，喂以標準鼠飼料 (北京科奧協力飼料有限公司，熱值為17.6 kJ/g)。動物自由取食和飲水。選擇30 只3.5 ～ 4.0 月齡雌性黑線倉鼠，單籠飼養適應2周后，隨機分為4組：21℃組 (21 ℃,n= 7) 和21 ℃急性高溫暴露組(21℃-H,n= 7)，動物在室溫條件下 (21 ℃) 飼養4 周；32.5℃組 (32.5 ℃,n= 8) 和32.5 ℃急性高溫暴露組 (32.5℃-H,n= 8)，動物轉移至暖溫條件下 (32.5 ℃) 馴化4 周。期間動物自由取食和飲水。此后21℃-H 組和32.5℃-H 組動物分別轉入高溫環境 (37 ℃)，21℃-H 組動物在46 h 和48 h 后各死亡1只，因此在48 h后終止急性高溫暴露。實驗動物處理通過溫州大學實驗動物福利和倫理委員會批準。

1.2 攝入能和消化率的測定

在急性高溫暴露期間，以食物平衡法測定攝入能和消化率。稱量添加飼料的重量，48 h后再次稱量剩余食物重量，以前后兩次食物重量差值，再扣除飼養籠內飼料殘渣重量，計算攝食量。收集食物殘渣、墊料和糞便置于恒溫干燥箱60 ℃烘至恒重，手工分離食物殘渣和糞便并稱量干重 (精確到0.001 g)。用氧彈熱量儀 (IKA C 2000，德國)測定烘干后食物和糞便的熱值。攝入能、消化能及消化率按以下公式計算 (Grodzinski and Wunder,1975; Liuet al., 2013)：

1.3 體溫

在急性高溫暴露期間，連續測定動物腹腔體溫 (body temperature, Tb)，在測定開始前，將體溫傳感器植入動物腹腔 (直徑2 mm 和長度14 mm,Destron Fearing, South St Paul, USA)，使用Pocket Reader 接近飼養籠接收體溫信號并自動存儲，在不干擾黑線倉鼠活動行為的情況下，獲取體溫數據。每3 h 測定1 次體溫，連續測定48 h，測定結束后導出體溫數據。

1.4 靜止代謝率 (resting metabolic rate, RMR) 和非顫抖性產熱 (nonshivering thermogenesis, NST)

急性高溫暴露48 h 后，立即測定動物RMR和NST。RMR 和NST 以開放式氧氣呼吸代謝儀(TSE, Germany) 測定。氣體經氣泵送達呼吸室內(1 000 mL/min)，呼吸室由生化培養箱控溫 (± 0.5 ℃)，呼吸室內的氣體通過干燥后以380 mL/min 速率輸送至氧分析儀 (TSE system)，抽樣測定氧氣濃度。氧分析儀每10 s 記錄1 次數據，由標準數據分析軟件 (TSE, Germany) 計算分析代謝率。RMR 測定溫度為 (30 ± 0.5) ℃ (屬于黑線倉鼠的熱中性區)，動物放入呼吸室適應1 h，RMR 連續測定2 h，以10 min 內連續穩定的最低值計算RMR。NST 以皮下注射重酒石酸去甲腎上腺素誘導的最大耗氧量來計算 (王建梅和王德華，2006; Zhaoet al.,2010)，劑量計算公式為：

NST 在 (25 ± 0.5) ℃下測定60 min。取10 min內連續最大耗氧率的平均值計算NSTmax，以NSTmax和RMR 的差值計算NST，RMR、NSTmax和NST均校正至標準溫度和空氣壓力條件，表示為mLO2/h。

1.5 組織線粒體狀態4呼吸率和COX活性

組織線粒體狀態4 呼吸率是指在無ADP 供應的條件下 (無ATP 生成)，線粒體內膜的最大耗氧率，該耗氧主要用于質子漏消耗的質子勢能梯度，而非生成ATP (Iossaet al., 2004)。實驗結束后斷頸處死動物。迅速分離腦、肩胛間BAT、心臟、肝臟、肺臟和腎臟和后腿部骨骼肌，置于液氮中速凍，轉移至-80 ℃冰柜保存備用。提取BAT、肝臟、肌肉線粒體蛋白 (Zhao and Wang,2005)。狀態4 呼吸率使用液相氧電極 (Hansatech Instruments, DW-1, England) 測定，測定溫度為30 ℃，基質液為225.0 mmol/L 蔗糖、50.0 mmol/L Tris、5.0 mmol/L MgCl2·6H2O、1.0 mmol/L EDTA和5.0 mmol/L KH2PO4(pH = 7.4)，以5.0 mmol/L琥珀酸和3.75 mol/L 魚藤酮為底物 (Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.，上海)。COX活性也在30 ℃下測定，基質液為7.5 mmol/L KH2PO4、3.75 mmol/L 抗壞血酸和0.3 mmol/L TMPD (pH =7.4)， 底物為細胞色素C (5 μL, 0.5 mg/mL,CAS9007-43-6, Macklin Co., Ltd.) (Zhao and Wang,2005)。

1.6 解偶聯蛋白實時熒光定量PCR分析

用TRIzol 試劑 (TAKARA, China) 提取BAT、肝臟、肌肉總RNA，以RNA 為模板反轉錄合成cDNA，然后使用羅氏實時熒光480 進行熒光定量(Forrentrasse CH-6343 Rotkreuz, Switzerland)，反應體系組成：模版cDNA 2 μL，SYBR Premix EX Tag TM (2 ×) 10 μL，引物序列見表1 (Zhaoet al., 2014)。

表1 引物序列Table 1 Gene specific primer sequence used for real-time RT-PCR analysis

1.7 器官組織MDA 和蛋白羰基水平，及SOD 和GSH-Px活性

取出肝臟、心臟、肺臟、腎臟、腦和骨骼肌，以預冷的0.9% NaCl 溶液將組織勻漿，勻漿液3 000 r/min離心15 min，取上清液。SOD以黃嘌呤氧化酶法 (羥胺法) 測定，取樣量為10%的勻漿液0.1 mL，在波長550 nm 處測定光吸收值，SOD 活性表示為U/mg 蛋白。GSH-Px 活性以比色法測定(南京建成生物工程研究所) 在波長420 nm 處的吸光度值，以每毫克蛋白每分鐘 (扣除非酶反應的作用) 將反應體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位，表示為U/mg。MDA 的測定體系為4.2 mL，取樣量為10%的勻漿液0.1 mL，532 nm處測定光吸收值，MDA 水平表示為nmol/mg 蛋白(南京建成生物工程研究所)。組織蛋白羰基含量以2, 4-二硝基苯肼 (DNPH) 比色法測定，被氧化后的蛋白質羰基含量增多，羰基可與DNPH 反應生成紅棕色2, 4-二硝基苯腙沉淀，將沉淀用鹽酸胍溶解后即可在分光光度計上讀取370 nm 下的吸光度值，羰基濃度用摩爾消光系數22 (mmol/L cm) 計算，羰基含量用每毫克蛋白含有多少納摩爾羰基表示 (Dubeyet al., 1996；段麗菊等，2005；陳可新等，2015)。用福林酚法測定勻漿上清液的蛋白濃度，以牛血清蛋白作為標準蛋白。

1.8 統計分析

數據處理采用SPSS 13.0 軟件包。攝入能和消化率、體溫、RMR 和NST 以雙因素方差分析法(two way ANOVA) 或者協方差分析法 (ANCOVA)進行統計分析，以體重為協變量。組織狀態4呼吸率和COX 活性、ucp基因表達、組織MDA 和蛋白羰基水平、SOD 和GSH-Px活性采用雙因素方差分析法進行統計分析。組間差異以Tukey post-hoc tests 多重比較進行分析。文中數據以平均值 ± 標準誤 (mean ± SE) 表示，P＜ 0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 攝入能和消化率

暖溫馴化對攝入能、糞能、消化能和消化率影響顯著，與21℃組相比，32.5℃組攝入能降低了25.2% (Ftem= 22.79，P＜ 0.01，圖1A)，糞能減少了51.6% (Ftem= 24.84，P＜ 0.01，圖1B)，消化能減少了18.2% (Ftem= 16.42，P＜ 0.01，圖1C)，而消化率顯著增加 (Ftem= 5.26，P＜ 0.05，圖1D)。攝入能、糞能和消化能受急性高溫暴露的顯著影響，21℃-H 組較21℃組分別降低了23.2%、40.5%和18.6% (攝入能，Fh= 17.64，P＜ 0.01；糞能，Fh= 6.74，P＜ 0.05；消化能，Fh= 17.26，P＜ 0.01)；但32.5℃-H 組與32.5℃組相比未發現顯著變化 (post hoc,P＞ 0.05)。

2.2 體重、RMR和NST

暖溫馴化和急性高溫暴露對體重的影響不顯著 (Ftem= 0.21，P＞ 0.05，Fh= 2.49，P＞ 0.05，圖1E)。RMR受暖溫馴化影響顯著，但未受急性高溫暴露的顯著影響 (Ftem= 15.05，P＜ 0.01，Fh=1.56，P＞ 0.05，圖1F)。NSTmax和NST 受暖溫馴化的顯著影響，32.5℃組比21℃組分別降低了47.1%和53.0% (NSTmax，Ftem= 45.98，P＜ 0.01；NST，Ftem= 29.99，P＜ 0.01)，急性高溫暴露顯著降低了NSTmax和NST，21℃-H 組比21℃組分別降低了21.3% 和27.4% (NSTmax，Fh= 6.14，P＜0.05，圖1G；NST，Fh= 5.39，P＜ 0.05，圖1H)，32.5℃-H 組比32.5℃組分別降低了16.1% 和21.7%，但組間差異未達到顯著水平。

2.3 晝夜代謝率

晝夜代謝率受暖溫馴化和急性高溫暴露的影響顯著，暖溫馴化使夜間代謝率降低了34.6%，使晝間代謝率降低了49.3%；急性高溫暴露使21℃組夜間和晝間代謝率分別降低了47.6%和29.8%，但急性高溫暴露對32.5℃組代謝率的影響未達到顯著水平 (夜間代謝率，Ftem= 47.55，P＜ 0.01，Fh= 64.90，P＜ 0.01；晝間代謝率，Ftem= 49.15，P＜ 0.01，Fh= 4.16，P＜ 0.05，圖2A、B、E、F)。

圖2 高溫暴露對黑線倉鼠代謝率和體溫的影響.21℃和32.5℃，動物分別馴化于室溫 (21 ℃) 和暖溫 (32.5 ℃)；21℃-H 和32.5℃-H，馴化于室溫和暖溫的動物分別急性暴露于高溫 (37 ℃)；數據為平均值 ± 標準誤，Ph：高溫暴露的影響；*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01. 不同字母 (a、b、c) 表示組間差異顯著 (P ＜ 0.05)Fig. 2 Effect of high temperature on metabolic rate and body temperature of striped hamsters. 21℃ and 32.5℃, animals were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃; 21℃-H and 32.5℃-H, animals that were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃ were acutely exposed to hot temperature (37 ℃) for 48 hours. Data are mean ± SE. Ph: effect of acute hot exposure; *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01. Different letters (a, b, c) above the columns indicate significant difference between the groups (P ＜ 0.05)

2.4 體溫

暖溫馴化對體溫的影響未達到顯著水平 (Ftem=0.34,P＞ 0.05)，但急性高溫暴露顯著影響體溫，21℃-H 組顯著高于21℃組 (Fh=16.67，P＜ 0.01，repeated measures ANOVA，圖2C、D)。暖溫馴化對夜間平均體溫 (Ftem= 2.52,P＞ 0.05) 和晝間平均體溫 (Ftem= 0.09,P＞ 0.05) 的影響不顯著，但急性高溫暴露使夜間和晝間平均體溫顯著增加 (夜間，Fh= 27.95，P＜ 0.01，圖2G；晝間，Fh= 13.29，P＜ 0.01，圖2H)。

2.5 BAT、肝臟和肌肉的COX 活性和狀態4 呼吸率

暖溫馴化對BAT、肝臟和肌肉的COX 活性影響顯著，與21℃組相比，32.5℃組分別降低了84.2%、50.0%和56.6% (BAT，Ftem= 22.35，P＜0.01，圖3A；肝臟，Ftem= 19.16，P＜ 0.01，圖3B；肌肉，Ftem= 42.93，P＜ 0.01，圖3C)。急性高溫暴露顯著抑制了肝臟的COX活性，21℃-H組比21℃組降低了23.3% (Fh= 4.48,P＜ 0.05; S-N-K post hoc,P＜ 0.05)，但對BAT 和肌肉COX 活性的影響未達到顯著水平 (BAT，Fh= 3.51，P＞ 0.05；肌肉，Fh= 0.09，P＞ 0.05)。BAT 狀態4 呼吸率受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響，與21℃組相比，21℃-H、32.5℃、32.5℃-H 組分別降低了53.0%、44.0%和56.2% (Ftem= 7.03，P＜ 0.05；Fh= 13.45，P＜ 0.01；S-N-K post hoc，P＜ 0.05，圖3D)。然而肝臟和肌肉的狀態4 呼吸率未受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響 (圖3E、F)。

圖3 高溫暴露對黑線倉鼠線粒體COX 活性、狀態4 呼吸率和解偶聯蛋白表達的影響. 21℃和32.5℃，動物分別馴化于室溫 (21 ℃) 和暖溫 (32.5 ℃)；21℃-H 和32.5℃-H，馴化于室溫和暖溫的動物分別急性暴露于高溫 (37 ℃)；數據為平均值 ± 標準誤，Ptem：溫度的影響，Ph：高溫暴露的影響；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01. 不同字母 (a、b、c) 表示組間差異顯著 (P ＜ 0.05)Fig. 3 Effect of high temperature on cox activity, state 4 respiratory and uncoupling protein expression of striped hamsters. 21℃ and 32.5℃, animals were kept at 21℃ or 32.5 ℃; 21℃-H and 32.5℃-H, animals that were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃ were acutely exposed to hot temperature(37 ℃) for 48 hours. Data are mean ± SE. Ptem: effect of temperature, Ph: effect of acute hot exposure; *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01. Different letters (a,b, c) above the columns indicate significant difference between the groups (P ＜ 0.05)

2.6 BAT、肝臟和肌肉的ucp基因表達

BAT的ucp1基因表達受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響，與21℃組相比，21℃-H、32.5℃、32.5℃-H 組分別降低了89.5%、80.1%和85.1%(Ftem= 51.09，P＜ 0.01；Fh= 80.07，P＜ 0.01；SN-K post hoc，P＜ 0.05，圖3G)。暖溫馴化和急性高溫暴露對肝臟ucp2基因表達的影響均未達到顯著水平 (Ftem= 3.58，P= 0.06；Fh= 3.07，P= 0.09，圖3H)，但二者的交互作用的影響顯著 (Ftem×h=5.44,P ＜0.05)。暖溫馴化對肌肉ucp3基因表達的影響未達到顯著水平 (Ftem= 0.88,P＞ 0.05)，急性高溫暴露顯著抑制了ucp3基因表達，21℃-H 組比21℃組降低了58.8% (Fh= 12.44，P＜ 0.01；S-NK post hoc，P＜ 0.05，圖3I)。

2.7 MDA和蛋白羰基水平

肝臟MDA 水平未受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響 (圖4A)。心臟、肺臟、腎臟和肌肉的MDA 水平均受暖溫馴化的顯著影響，32.5℃組比21℃組分別降低了11.4%、34.4%、24.5% 和44.0% (心臟，Ftem= 8.36，P＜ 0.01，圖4B；肺臟，Ftem= 11.07，P＜ 0.01，圖4C；腎臟，Ftem=20.06，P＜ 0.01，圖4D；肌肉，Ftem= 11.42，P＜0.01，圖4E)，但急性高溫暴露對這些組織MDA水平的影響未達到顯著水平 (心臟，Fh= 0.26，P＞ 0.05；肺臟，Fh= 0.02，P＞ 0.05；腎臟，Fh=0.03，P＞ 0.05；肌肉，Fh= 2.19，P＞ 0.05)。暖溫馴化和急性高溫暴露對腦組織MDA 水平的影響未達到顯著水平 (圖4F)。

圖4 高溫暴露對黑線倉鼠肝臟、心臟、肺臟、腎臟、肌肉和腦的丙二醛、蛋白羰基、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的影響.21℃和32.5℃，動物分別馴化于室溫 (21 ℃) 和暖溫 (32.5 ℃)；21℃-H 和32.5℃-H，馴化于室溫和暖溫的動物分別急性暴露于高溫(37 ℃)；數據為平均值 ± 標準誤，Ptem：溫度的影響，Ph：高溫暴露的影響；*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Fig. 4 Effect of high temperature on malondialdehyde (MDA), protein carbonyl, superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px)in liver, heart, lung, kidney, muscle, and brain of striped hamsters. 21℃ and 32.5℃, animals were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃; 21℃-H and 32.5℃-H,animals that were kept at 21 ℃ or 32.5 ℃ were acutely exposed to hot temperature (37 ℃) for 48 hours. Data are mean ± SE. Ptem: effect of temperature, Ph: effect of acute hot exposure; *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

肝臟和心臟的蛋白羰基水平未受暖溫馴化的顯著影響 (肝臟，Ftem= 0.20，P＞ 0.05，圖4G；心臟，Ftem= 0.06，P＞ 0.05，圖4H)，但受急性高溫暴露的影響顯著，急性高溫暴露降低了蛋白羰基水平 (肝臟，Fh= 19.84，P＜ 0.01；心臟，Fh=4.95，P＜ 0.05)。暖溫馴化和急性高溫暴露對肺臟蛋白羰基水平的影響未達到顯著水平 (圖4I)。溫度對腎臟蛋白羰基水平的影響顯著 (Ftem= 6.71，P＜ 0.05，圖4J)，但急性高溫暴露的影響未達到顯著水平 (Fh= 1.46,P＞ 0.05)。暖溫馴化和急性高溫暴露對肌肉和腦組織蛋白羰基水平的影響均未達到顯著水平 (圖4K、L)。

2.8 SOD和GSH-Px活性

肝臟SOD 活性受暖溫馴化的影響顯著，32.5℃組比21℃組降低了33.7% (Ftem= 97.93，P＜ 0.01，圖4M)，但急性高溫暴露后肝臟SOD 活性未發生顯著變化 (Fh= 0.18,P＞ 0.05)。暖溫馴化和急性高溫暴露未顯著影響心臟 (圖4N)、肺臟 (圖4O) 和腎臟 (圖4P) 的SOD 活性。肌肉和腦組織SOD 活性受暖溫馴化的影響顯著，但急性高溫暴露后未發生顯著變化 (肌肉，Ftem= 5.50，P＜0.05，Fh= 1.53，P＞ 0.05，圖4Q；腦，Ftem=4.88，P＜ 0.05，Fh= 1.54，P＞ 0.05，圖4R)。

肝臟GSH-Px 活性在不同溫度組間未出現顯著差異，急性高溫暴露后也未發生顯著變化 (圖4S)。心臟、肺臟和腎臟GSH-Px 活性受暖溫馴化的影響顯著，32.5℃組比21℃組分別降低了20.6%、42.9%和24.0% (心臟，Ftem= 25.91，P＜ 0.01，圖4T；肺臟，Ftem= 48.98，P＜ 0.01，圖4U；腎臟，Ftem= 20.68，P＜ 0.01，圖4V)，但急性高溫暴露后均未發現顯著變化。與上述組織不同，肌肉GSH-Px 活性受暖溫馴化和急性高溫暴露的影響顯著， 21℃-H 組比21℃組升高了25.6%，32.5℃-H 組比32.5℃組升高了10.4% (Ftem= 9.14，P＜ 0.01，Fh= 8.87，P＜ 0.01，圖4W)。腦組織GSH-Px 活性未受暖溫馴化和急性高溫暴露的顯著影響 (圖4X)。

3 討論

溫度是自然界中最主要的環境因子之一，對動物的生理和行為均具有顯著影響 (Zhang and Wang, 2007；王德華，2011; Zhanget al., 2018)。許多小型哺乳動物通過能量代謝適應性調節以應對環境溫度的變化，其能量攝入和代謝產熱在低溫下顯著升高，而當環境溫度升高時則顯著降低，從而維持穩定的體溫調節 (王德華，2011)。本研究發現，黑線倉鼠在暖溫下攝入能、消化能和糞能顯著降低。這與其他嚙齒類動物對溫度的反應相似，如布氏田鼠 (Lasiopodomys brandtii)、長爪沙鼠 (Meriones unguiculatus)、黑線毛足鼠 (Phodopus sungorus)、 白足鼠 (Peromyscus maniculatus sonoriensis) 等 (Hammondet al., 2001; Kauffmanet al., 2001; Song and Wang, 2006; Li and Wang,2007)，這些研究結果表明，降低能量攝入是小型哺乳動物應對暖溫環境的重要能量學對策。本研究還發現，長期馴化于32.5 ℃的黑線倉鼠在經歷急性高溫 (37 ℃) 暴露后，其攝入能、消化能和糞能未發生顯著變化，暗示急性高溫對動物能量攝入的影響可能與動物生存的環境溫度有關，動物生存的環境溫度越低，其能量攝入受急性高溫的影響越大。

動物能量攝入的變化與能量支出有關 (Kauffmanet al., 2001)。本研究發現暖溫下的黑線倉鼠RMR 和NST 均顯著降低。隨著環境溫度升高，動物的適應性產熱速率一般會顯著降低，從而導致能量攝入降低，以此維持能量攝入與支出的平衡，進而維持穩定的體溫調節 (Hammondet al., 2001;Kauffmanet al., 2001; Song and Wang, 2006; Li and Wang, 2007；王德華，2011)。許多小型哺乳動物的研究結果與本文相似，反映了動物應對暖溫環境的一般適應對策 (Hammondet al., 2001; Kauffmanet al., 2001)。本研究進一步發現，生活在暖溫環境下的黑線倉鼠適應性產熱沒有受到急性高溫暴露的顯著影響，而生活在室溫下的黑線倉鼠NSTmax和NST 在急性高溫暴露后分別降低了21.3%和27.4%，晝間和夜間平均體溫分別升高了1.4 ℃和2.0 ℃，暗示動物生存的環境溫度越低，對極端高溫天氣的敏感性越高。

BAT、肝臟和肌肉是機體主要的代謝產熱器官，其線粒體呼吸率受溫度的顯著影響 (Hulbertet al., 2002; Zhang and Wang, 2007; Li and Wang,2007)。在低溫下，許多動物的BAT、肝臟和肌肉線粒體呼吸率顯著升高，與其整體水平上代謝率和適應性產熱的變化一致，是增加代謝產熱、維持穩定體溫調節的重要機制之一 (Trayhurnet al.,1987; Hulbertet al., 2002; Zhang and Wang, 2007;Li and Wang, 2007; Jastrochet al., 2007; Zhanget al., 2012)。本研究發現，暖溫下黑線倉鼠BAT、肝臟和肌肉COX 活性，以及BAT 狀態4 呼吸率均顯著降低。與此相似，暖溫環境下布氏田鼠、長爪沙鼠、坎氏毛足鼠 (Phodopus campbelli) 和小鼠(Mus musculus) 等的COX 活性或者狀態4 呼吸率也顯著降低 (Heldmaier and Buchberger, 1985; Zhang and Wang, 2007; Li and Wang, 2007; Yanget al.,2013; Zhaoet al., 2022a)。本研究還發現，急性高溫暴露后肝臟COX 活性，以及BAT、肝臟和肌肉解偶聯蛋白表達顯著降低。這些研究結果再次證實，線粒體呼吸率和解偶聯率是適應性產熱的分子機制 (Parkeret al., 2009)。本研究表明，溫度對代謝活性器官線粒體呼吸率的影響具有組織差異，BAT 對溫度的反應較肝臟和骨骼肌更敏感；急性高溫暴露對線粒體呼吸率的影響與動物生存的環境溫度有關，生存的環境溫度越低，受極端高溫的影響越大。

動物的代謝水平與其生長、發育、衰老和壽命等很多生活史特征相關，受環境溫度的影響 (Simonset al., 2011; Baoet al., 2020; Zhaoet al.,2022b)。自由基是代謝過程中產生的活性物質，被認為是細胞內能量代謝的副產物，能夠誘發一系列的氧化反應。組織自由基水平與代謝有關，自由基生成過量，會造成組織核酸損傷、蛋白損傷和脂質損傷，或影響細胞的正常生理功能 (Sohal,2002; Speakmanet al., 2004; Speakman and Selman,2011; Selmanet al., 2013)。近年來，關于代謝率與壽命的關系，及其與組織自由基水平，或者氧化損傷的關系進行了較為廣泛的研究。其中，自由基假說是當前闡述上述關系的主流假說之一，該假說認為影響衰老和壽命的關鍵機制是組織產生的自由基水平，及其造成的氧化損傷，并與不同代謝水平密切相關 (Echtayet al., 2002; Vendittiet al., 2004; Fridellet al., 2005; Padalko, 2005)。盡管自由基假說解釋了ROL 假說不能解釋的現象，但小鼠、大鼠、果蠅等模式生物的研究結果不盡相同 (Speakmanet al., 2004; Vendittiet al., 2004; Balabanet al., 2005; Fridellet al., 2005)。而本研究發現，馴化于暖溫環境的野生黑線倉鼠肝臟和腦的MDA 水平未發生顯著變化，而心臟、肺臟、腎臟和肌肉的MDA 水平均顯著降低。自由基作用于脂質發生過氧化反應，氧化終產物為MDA，所以MDA 是反映組織脂質氧化損傷程度的重要指標之一 (Osorioet al., 2003)。蛋白羰基是衡量蛋白質氧化損傷的最主要指標之一，組織中蛋白羰基水平高低反映了蛋白質氧化損傷程度的大小 (Haucket al., 2019)。本研究發現，馴化于暖溫環境的野生黑線倉鼠肝臟、心臟、肺臟、肌肉和腦組織的蛋白羰基水平未發生顯著變化，而腎臟的蛋白羰基水平顯著升高。與本研究類似，不同溫度或不同繁殖狀態條件下的黑線倉鼠、堤岸田鼠 (Myodes glareolus)、布氏田鼠、長爪沙鼠等組織的氧化損傷程度不同 ( Sohalet al., 1995; Xuet al., 2014;Zhaoet al., 2015；陳可新等，2015；O?dakowski and Taylor, 2018; Khakisahnehet al., 2019)。這些研究結果雖然沒有涉及衰老和壽命等生活史特征，但也表明了機體的組織氧化應激和氧化損傷具有組織差異。鑒于此，自由基假說應該考慮組織特異性的氧化應激和損傷程度與代謝率的關系。

此外，本研究發現急性高溫暴露沒有顯著增加黑線倉鼠肝臟、心臟、肺臟、腎臟、肌肉、腦組織MDA 和蛋白羰基水平。急性高溫暴露下的巖鼠 (Micaelamys namaquensis) 肝臟的MDA 水平顯著升高，而腎臟和腦組織沒有發生顯著變化 (Jacobset al., 2021)。紋鼠 (Rhabdomys dilectus) 的腦組織在急性高溫暴露后MDA 和蛋白羰基水平顯著升高，而肝臟和腎臟沒有發生顯著變化 (Jacobset al., 2020)。這些研究結果表明，急性高溫暴露對氧化應激和損傷的影響也具有組織差異。機體內存在對抗自由基的抗氧化防御系統，包括各種抗氧化酶，例如SOD 和GSH-Px，二者都是機體抗氧化酶系的重要組成成員 (Kankofer, 2001)。本研究表明，暖溫馴化使黑線倉鼠肝臟、肌肉的SOD 活性顯著降低，但對心臟、肺臟、腎臟和腦影響未達到顯著水平，暖溫馴化使心臟、肺臟、腎臟GSH-Px 活性顯著降低，使肌肉的GSH-Px 活性顯著升高，而對肝臟無顯著影響。對紋鼠的研究發現高溫使肝臟的SOD 活性顯著升高，對腎臟、肌肉和腦等無顯著影響 (Jacobset al., 2020)。急性高溫暴露下巖鼠腎臟的SOD 活性顯著降低，對肝臟、腦等其他器官和組織無顯著影響 (Jacobset al.,2021)。這些研究再次表明，抗氧化能力和自由基水平在不同器官或組織間存在顯著差異，引起差異的原因以及這種差異在主要器官和組織之間是否普遍存在，尚需進一步研究 (Davidovi?, 1999;Selmanet al., 2002)。

機體代謝率、組織線粒體呼吸率與氧化磷酸化偶聯程度都是影響線粒體氧自由基生成速率的重要因素，與組織自由基水平和氧化損傷的程度密切相關 (Balabanet al., 2005)。本研究利用暖溫長期馴化或高溫急性暴露的環境條件處理黑線倉鼠，發現其適應性產熱顯著降低，以利于維持穩定的體溫調節。與動物整體水平適應性產熱的變化相似，暖溫長期馴化或高溫急性暴露使呼吸率顯著降低，線粒體氧化和磷酸化偶聯程度顯著增加。然而在此環境下，機體主要組織器官 (肝臟、心臟、肺臟、腎臟、肌肉、腦) 的氧化應激與氧化損傷未出現一致的反應。對實驗小鼠的研究發現，代謝率高的個體，肌肉組織呼吸率、線粒體氧化磷酸化解偶聯率較高，自由基水平較低 (Speakmanet al., 2004; Speakman and Selman, 2011)。然而低溫暴露大鼠的代謝率顯著增加，但與此同時肝臟、心臟和骨骼肌的自由基水平升高，氧化損傷顯著增加 (Vendittiet al., 2004)。不同環境溫度(高溫或者低溫) 長期馴化或短期急性暴露對布氏田鼠、長爪沙鼠、實驗大鼠和小鼠等的主要組織器官線粒體呼吸率和氧化應激與氧化損傷也具有差異，這些研究結果與本研究結果相似。本研究結果不支持自由基假說。這些研究結果暗示，機體代謝率、主要組織器官線粒體呼吸率、解偶聯和氧化應激與氧化損傷可能具有物種特異性，以及組織器官特異性，這對深入理解野生小型哺乳動物應對高溫環境的適應策略具有生理學和生態學意義。

致謝：溫州大學動物生理生態學研究組碩士研究生楊瑞、張開元、趙真協助動物代謝率測定，特此致謝。