林麝不同組織miRNA表達譜

余苗杰 徐忠鮮 蔣雪梅 王春花 趙嬋娟 戚文華* 竭航

（1 重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404100）（2 西華師范大學生命科學學院，南充 637009）（3 湖南農業大學動物醫學院，長沙 410125）（4 重慶三峽職業學院，重慶 404155）（5 重慶市藥物種植研究所，重慶 408435）

林麝 (Moschus berezovskii) 是一種藥用經濟動物，其雄麝分泌的麝香是傳統中藥的重要成分，也是香水的定香劑，具有極高的藥用價值和經濟價值，市場價格是黃金價格的3 倍以上。曾經在經濟利益的驅動下，非法捕獵野生麝資源獲取麝香的情況時有發生，加上麝科動物生存環境遭到嚴重破壞，導致野生種群數量驟減，已經面臨極危處境，必須采取有效的保護和管理措施 (姜海瑞和徐宏發，2007)。麝類動物已經列入世界自然保護聯盟的瀕危物種紅色目錄中，在《中國生物多樣性紅色名錄》 中被列為極危等級 (蔣志剛，2020)。中國是麝類動物的主要分布區，為了保護這一珍貴的動物資源，我國將所有麝類動物均列為國家一級重點保護野生動物 (國家重點保護野生動物名錄，2021)。由于麝種群數量顯著下降，導致麝香的產量急劇下降。為了緩解麝香的供求矛盾，保護野生麝類資源，1958 年我國開始人工養麝 (周繼武等，2000)。由于人工養麝技術不成熟、馴養環境不規范和發病率高等因素，導致圈養麝種群數量增長緩慢 (呂向輝等，2009; Qiet al.,2011)。

microRNA (miRNA) 是一類長18 ～ 25 nt 的非編碼RNA 分子，廣泛分布于動植物的細胞，具有高度的保守性、時序性和組織特異性 (Aduret al.,2017；紀會等，2019)。研究表明，miRNA 通過其序列與目標mRNA 互補配對結合，從而使目標mRNA 降解或抑制其翻譯，最終在轉錄后水平抑制目標基因的表達 (Kato and Slack, 2008)。目前，已經在哺乳動物發現1 000 余種保守的miRNAs(Mendell and Olson, 2012)，其與靶基因之間有一對多和多對一的互作關系 (Shinet al., 2010)。miRNA在動植物的生命活動過程中發揮著重要作用，已證實miRNA 不僅與消化系統疾病 (程海霞等，2017)、胰腺癌 (Xuet al., 2018) 和乳腺癌 (Maetal., 2007) 等多種疾病的發生與發展密切相關，還參與到神經系統發育 (Katarovaet al., 1998)、脂肪形成 (Guoet al., 2017)、卵巢發育 (Zhanget al.,2016) 等多種生長發育過程。有些miRNA 保守性低，表達水平也較低，目前這類miRNA 的生物學功能尚未清楚 (Mendell and Olson, 2012)。

生物組織或器官共表達的miRNAs 通常在維持細胞組織的基礎生命活動方面發揮重要作用，研究不同器官組織共表達的miRNAs 具有重要意義。心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織是林麝生理過程的重要器官或組織，我們使用RNA-seq 技術在Hi-seq 2500 測序平臺上對林麝的這6 種組織進行small RNA 高通量測序?；诹主晷呐K、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織miRNAs的表達譜，本研究進一步分析林麝這6種組織miRNAs 的表達水平，尋找不同組織共表達的miRNA 和特異表達miRNA，探索特異表達miRNA 與其靶基因的相互作用，并且通過RT-qPCR 驗證目標特異表達miRNA 在林麝血液組織中的表達。通過對林麝的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織miRNAs 表達譜的研究，為進一步探索林麝不同組織miRNAs 與其靶基因的調控作用提供科學依據和新思路。

1 研究方法

1.1 樣品采集

實驗動物為重慶市藥物種植研究所林麝繁育基地1 只自然死亡的雄性林麝，快速采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織，分別進行分裝和標記。將樣品送往實驗室先置于4 ℃下冷藏，然后置于-80 ℃左右的干冰中保存，并快遞郵寄到測序公司。所有樣品采集符合動物保護、動物福利和倫理原則，符合國家實驗動物福利倫理的相關規定。

1.2 文庫的制備與測序

使用RNAiso 試劑從樣品組織中提取總RNA，并進行分離，然后再用Qubit 3.0 熒光儀測定RNA的純度 (吸光度比，260/280) 和產率，使用Agilent Bioanalyzer 測定RNA 完整性數 (RIN)，所有樣品的RNA 完整性數大于8.5，總RNA 樣本保存于-80 ℃下備用。RNA 樣本進行純化后，采用Hiseq 2500 測序平臺進行測序 (RNA-seq)，測序數據已上傳NCBI數據庫 (PRJNA541415)。

1.3 質量控制

為保證信息分析的質量，測序完成后首先處理原始數據 (raw reads)，將原始數據進行去接頭、去污染和去除低質量的相關處理后，再對其進行徹底過濾，過濾掉17 bp以下及35 bp以上的reads，得到純凈的干凈序列 (clean reads)，然后對這6 個樣本的干凈序列進行篩選，并對所獲得的small RNA (sRNA) 長度進行統計。本研究中選取17 ～35 bp 的reads，后續分析可以直接使用這些高質量的reads。

1.4 已知miRNA的鑒定

使用Bowtie 軟件 (Langmeadet al., 2009) 將測序所得的林麝sRNA 的clean reads 定位到林麝基因組；將比對到林麝基因組上的sRNA 與miRBase 數據庫中己知動物miRNA 前體序列進行比對，識別和鑒定各樣本已知的miRNA。

1.5 miRNA表達水平

首先對林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織miRNAs 的表達量進行統計，用RPM(Reads of exon model per Million mapped reads) 進行表達量歸一化處理 (Jieet al., 2019)。RPM = Exon Mapped Reads × 106/Total Mapped Reads，指每100 萬個匹配上的片段中外顯子的片段數，用RPM 標準化后的數據可直接用于比較不同組織樣本中miRNA 的表達水平，也可直接用于miRNA差異表達分析。為明確不同miRNAs 在林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中的表達特征，本研究選取表達豐度RPM ≥ 0.01 的miRNAs進行分析。為了比較林麝不同組織miRNAs 的表達水平，根據miRNA 的表達量RPM 值將miRNA表達水平分為以下5 類：(1) 超低表達的miRNA(0 ＜ RPM ＜ 1)；(2) 低度表達的miRNA (1 ≤RPM ＜ 10)；(3) 中度表達的miRNA (10 ≤ RPM ＜100)；(4) 高表達的miRNA (100 ≤ RPM ＜ 600)；(5) 超高表達的miRNA (RPM ≥ 600)。特異miRNA是指某種miRNA 僅在某一器官或組織中表達(RPM ≥ 0.01)，而在其他器官或組織中不表達(RPM ＜ 0.01)。

1.6 miRNA靶基因互作分析

miRNA 互作是指為完成特定生物功能，多個miRNAs以協同和配合的方式靶向下游的基因。其可以特異性結合靶基因3′UTR 來抑制轉錄后的基因表達。24 521 條已被miRBase 數據庫收錄的miRNAs 為本研究的基礎。我們利用10 個miRWALK (http://www. umm. uni heidelberg. de/apps/zmf/mirwalk) 的數據庫：PITA、RNAhybrid、PICTAR4、 DIANA-mT、 PICTAR5、 TargetScan、miRDB、miRanda、miRWalk與RNA22，然后使用生物信息學軟件Starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/) 預測分析不同組織中miRNAs 的靶向基因，用在線工具string 分析得到靶向基因互作網絡后，再用Cytoscape3.7.2 (www. cytoscape. org) 把miRNAs 所預測到的靶基因互作網絡進行可視化分析。

1.7 統計分析

采用T-test 檢驗不同器官組織miRNAs 表達豐度是否存在差異，顯著水平設置為P＜ 0.05。相關數據處理、分析用SPSS 18.0軟件進行。

1.8 實時定量PCR驗證

在林麝肝臟miRNA 表達譜中隨機選取9 個miRNAs，以U6 snRNA 作為內參基因，采用Taq-Man miRNA Assays 定量試劑盒，檢測候選miRNAs 在化膿病和健康林麝肝臟中的表達量，相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算 (Deoet al., 2011)。候選miRNAs和內參基因引物序列信息見表1。

表1 miRNAs定量PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of miRNAs for RT-qPCR

2 結果

2.1 林麝不同器官和組織miRNAs表達量分析

研究結果顯示，在林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中，大多數miRNAs的表達屬于超低表達水平 (0 ＜ RPM ＜ 1) 和低度表達水平(1 ≤ RPM ＜ 10)，miRNA 的超低表達水平分別占36.36%、35.48%、32.34%、41.63%、37.37%和37.08%，miRNA 的低度表達水平分別占25.10%、27.26%、27.94%、23.92%、24.30%和25.70%。林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織有17.40% ～ 20.27%的miRNAs屬于中度表達水平(10 ≤ RPM ＜ 100)，分別占19.87%、19.74%、19.91%、17.40%、19.97%和20.27%；林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中高表達水平和超高表達水平的miRNAs比例較接近 (圖1)。

圖1 林麝不同器官和組織miRNA表達水平Fig. 1 Expression levels of all miRNA in different organs and tissues of forest musk deer

2.2 林麝不同器官和組織共表達miRNAs分析

生物組織或器官共表達的miRNAs通常在維持組織細胞的基礎生命活動方面發揮重要作用，因此，研究不同器官和組織共表達的miRNAs具有重要意義。林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中共表達的miRNAs 有1 650 個 (表達豐度 ≥ 0.01)，選取這6 種器官和組織中表達豐度最高的前20 個miRNAs 進行比較分析，這些共表達miRNAs的表達水平存在顯著性差異 (P＜ 0.05)。本研究發現，林麝心臟中miR-451a 的表達水平較高，肝臟、脾臟、肺臟、腎臟中miR-21 的表達水平較高，肌肉組織中miR-99b的表達水平較高；而miR-127、miR-30f、miR-30f、miR-22、miR-451a和miR-30f在各器官和組織中的表達水平較低 (圖2)。

圖2 林麝不同器官和組織共表達miRNA及其表達水平. A、B、C、D、E和F分別表示心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織Fig. 2 co-expressed miRNA and their expression level in different organs and tissues of forest musk deer. A, B, C, D, E and F represents heart, liver, spleen, lung, kidney, and muscle tissue, respectively

在林麝6 種器官和組織的miRNAs 共表達譜中，miR-451a 在林麝心臟中表達量最高，其次是miR-27b-3p、 miR-100-5p、 miR-26c 和miR-125c(圖2A)，表達量最低的是miR-7b。miR-143-3p 在林麝肝臟中表達量最高，其次是miR-122-5p、miR-21和miR-21-5p，表達量最低的是miR-3065-5p(圖2B)。林麝脾臟中，miR-143-3p 表達量最高，其次是miR-146a-5p、miR-10c-5p、miR-10b-5p，表達量最低的是miR-124b-3p (圖2C)。林麝肺臟中，miR-21-5p 表達量最高，其次是miR-21、miR-99b 和miR-30a-5p，表達量最低的是miR-124b-3p(圖2D)。林麝腎臟中，miR-10c-5p 表達量最高，其次是miR-10b-5p、miR-143-3p 和miR-30a-5p，表達量最低的是miR-7b (圖2E)。林麝肌肉組織中，miR-99b 表達量最高，其次是miR-99a-5p 和miR-99a，miR-124b-3p 表達量最低 (圖2F)。由此可知，在林麝6種器官和組織中有大量共表達的miRNAs，但是，共表達的同種miRNAs在不同器官和組織中的表達水平存在顯著差異 (P＜ 0.05)。

2.3 林麝不同器官和組織中特異表達miRNAs分析

林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中特異表達的miRNAs數量分別為86個、54個、44 個、68 個、83 個和50 個，存在顯著差異 (P＜0.01)。分別選取6 種器官和組織中表達豐度最高的前20 個miRNAs 進行比較分析 (圖3)。林麝心臟特異表達miRNAs 中，表達豐度最高的是miR-208a-3p，含量高達65.20%，其次是miR-133a-3p、miR-3546，最低的是miR-338a-3-5p (圖3A)。林麝肝臟特異表達miRNAs 中，表達豐度最高的是miR-122-3p (圖3A)，含量高達57.79%，其次是miR-432-3p、miR-433-5p，最低的是miR-375 (圖3B)。林麝脾臟特異表達miRNAs 中，表達豐度最高的是miR-142-5p，含量為20.35%以上，其次是miR-451、miR-1244，最低的是miR-219 (圖3C)。林麝肺臟特異表達miRNAs中，表達豐度最高的是miR-956-3p，含量為21.78%，其次是miR-34-5p、miR-281-3p，最低的是miR-18b-5p (圖3D)。林麝腎臟特異表達miRNAs 中，表達豐度最高的是miR-450b-3p，含量為12.47%，其次是miR-6516-5p、miR-668-3p，最低的是miR-210 (圖3E)。林麝肌肉組織特異表達miRNAs中，表達豐度最高的是miR-205-3p，含量為12.47%，其次是miR-183-3p、miR-3195，最低的是miR-124 (圖3F)。由此可知，林麝6種器官和組織中均有特異性表達的miRNAs，但心臟中部分特異表達miRNA 的水平遠遠高于其他5種器官和組織。

圖3 林麝不同器官和組織特異miRNA及其表達水平. A、B、C、D、E和F分別表示心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織Fig. 3 Specific miRNA of different organs and tissues and their expression levels in the forest musk deer. A, B, C, D, E and F represents heart, liver, spleen, lung, kidney, and muscle tissue, respectively

2.4 林麝肝臟特異表達miRNAs靶基因功能分析

林麝肝臟中有54 個特異表達的miRNAs 作用于14 937 個靶基因，通過GO 富集分析發現這些特異表達miRNAs的靶基因主要定位于細胞質、細胞核和線粒體，主要參與DNA 轉錄與結合 (GO:0000977-GO: 0001228)、肌動蛋白絲過程的調控(GO: 0032970)、蛋白激酶活性 (GO: 0004672)、細胞黏著力 (GO: 0098609)、多細胞生物發育的調節(GO: 2000026)、磷酸轉移酶活性 (GO: 0016773) 等功能 (P＜ 0.01；圖4A)。為了進一步探討林麝肝臟中特異表達miRNAs靶基因的功能，對其靶基因進行了KEGG 分析，顯著富集的KEGG 通路主要涉及Wnt 信號通路 (ko04310)、cAMP 信號通路(ko04024)、ECM 受體相互作用 (ko04512)、Notch信號途徑 (ko04330)、AMPK 信號通路 (ko04152)、B 細胞受體信號通路 (ko04662)、內分泌和代謝疾病 (ko09167)、生物晝夜節律 (ko04710)、細胞外基質與受體相互作用信號通路 (ko04512)、脂肪細胞因子信號通路 (ko04920)、 肥厚型心肌病(ko05410)、基底細胞癌 (ko05217)、病毒性心肌炎(ko05416)、膽汁 (ko04976) 與腎素 (ko04924) 的分泌等 (P＜ 0.01；圖4B)。

圖4 林麝肝臟特異表達miRNA靶基因GO和KEGG分析Fig. 4 GO and KEGG analysis of specific miRNA-target genes in the liver of forest musk deer

2.5 miRNA表達驗證

為驗證高通量測序數據，從林麝肝臟miRNA表達譜中隨機抽取9 個miRNAs 進行RT-qPCR 驗證。以U6 snRNA 作為內參，分別對肝臟化膿病和健康林麝的靜脈血miR-433、miR-30a-5p、miR-365-5p、 miR-339a、 miR-155、 miR-17-5p、 miR-25、let-7a-5p、let-7g、miR-10b 進行熒光定量PCR實驗，其miRNA表達量與miRNA測序結果基本一致 (圖5)。

圖5 miRNAs 在健康和化膿病林麝肝臟中的定量表達和測序表達分析Fig. 5 Comparison of quantitative expression and sequencing of miRNAs in liver of health and abscess forest musk deer

3 討論

近年來，關于miRNAs 的研究取得了大量成果，在動物基因組中有20% ～ 30%的基因受到miRNA 的調控 (Starket al., 2005)，miRNA 不僅參與到多個生理過程中，而且在疾病的發生發展過程中發揮著重要調控作用，并且miRNA 可作為疾病診斷及治療的分子標記物 (Lee and Dutta, 2009;Li and Kowdley, 2012; Shiet al., 2019)。研究發現，miRNA 參與機體免疫過程的各個環節中，與自身免疫性疾病的發病機制有關 (Lawrie, 2007)。miRNAs 特異性地結合到下游靶基因3′端非翻譯區(3′UTR) 發揮翻譯抑制作用或引發mRNA 降解，從而靶向負調控下游靶基因 (Hede, 2005)。通過高通量測序法比較唐氏綜合癥胎兒和健康者miRNAs表達譜，發現有149 個差異表達的miRNAs，其中miR-1、 miR-320b、 miR-196b、 miR-4732-5p 和miR-486-5p 與免疫基因的調控作用密切相關，參與造血或淋巴器官的發育、胸腺發育和T/B細胞分化活動。同時證實大量差異表達miRNAs通過調控靶基因mRNA 的表達，從而影響免疫調節通路，進而引起T/B 細胞系統紊亂 (Xuet al., 2013a,2013b)。miRNA-143 在綿羊體內各個組織中都有表達，在綿羊胚胎發育和器官形成中具有重要的調控作用 (Gonget al., 2020)，miRNA-143 也曾被報道參與癌癥發生的過程，與胃癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥的發生有密切關系，并能發揮腫瘤抑制作用 (Wenet al., 2020)。在藏黃牛和宣漢黃牛心臟組織的研究中，發現大量差異表達的miRNAs，這些miRNAs參與心肌細胞增殖及能量代謝等生理過程 (Chenet al., 2020)。由此推測，組織或器官特異表達或差異表達miRNAs 發揮重要生物學功能。

本研究利用高通量測序技術對林麝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織進行small RNA測序，構建了其miRNAs 表達譜，篩選出1 650 個共表達的miRNAs，其中let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、 miR-127、 miR-186、 miR-21、 miR-22、miR-23b、 miR-26a、 miR-26c、 miR-27b、 miR-29a、miR-30f、miR-3596、miR-451a、miR-99b 可能與林麝的生理過程、疾病發生發展密切相關。據研究表明，let-7 家族負調控抑癌基因，當let-7家族過度低表達可抑制多種腫瘤的發展 (Boyerinaset al., 2010)。表達下調的miR-26a 通過誘導MYC促使淋巴瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤的進展 (Kotaet al., 2009)。在本研究中，let-7a、let-7c、let-7d、let-7e 在健康林麝的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和肌肉組織中的表達量普遍較低，miR-126 在林麝心臟、肝臟和脾臟中表達水平較高，這可能與miR-126 通過負向調控PI3K 通路抑制癌細胞的增殖有關 (Zhanget al., 2008)。值得注意的是，在林麝6 種器官和組織特異表達的miRNAs 中，心臟中有部分特異表達miRNAs 的表達水平遠遠高于其他5 種器官和組織，這些特異表達miRNA 靶基因主要定位在細胞質、細胞核、線粒體，主要功能與蛋白泛素化修飾、DNA 結合、ATP 結合、蛋白轉運、細胞信號傳遞等有關；KEGG通路分析表明顯著富集的功能通路主要為泛素介導的蛋白降解途徑、核苷酸切除修復、p53 信號通路、脂肪酸代謝等；這暗示了林麝心血管系統的生理功能與特異表達miRNA的調控作用密切相關。有研究表明，高度保守的miR-133 和miR-1 參與肌肉形成、心臟發育和心肌發生；miR-499 的表達可能與胚胎干細胞向心肌細胞的分化密切相關；在壓力應激和甲狀腺功能減退時，miR-208 可特異性活化b 型肌球蛋白重鏈基因 (Myosin heavy chain, MHC) 的表達，從而調節心肌增殖和心臟的生理功能 (孫吉和陳小平，2011)；鑒于此，我們推測林麝心血管系統中特異表達miRNA 的改變與多種心血管疾病的發生和發展有關。在心衰患者與健康者研究中，患者血液中miR-423-5p的表達上調3倍以上，證實這個miRNA 可作為心臟功能衰竭的特異標志物 (Tijsenet al., 2010)。另外，在冠心病患者血液中發現多個miRNA 的異常表達 (Tijsenet al., 2010; Fichtlschereret al., 2010)。因此，研究血液中特異miRNA 表達水平的變化，對心血管疾病的診斷和預后有重要參考價值，這也表明了生物不同器官或組織特異表達的miRNA 可能在特定器官或組織中發揮特定的功能。

研究表明，miRNA 通過負調控基因的表達參與生物體疾病的發生、發展過程 (Koralovet al.,2008)。林麝肝臟特異表達miRNA 靶基因富集到Wnt 信號通路 (ko04310)、 cAMP 信號通路(ko04024)、ECM 受體相互作用 (ko04512)、Notch信號途徑 (ko04330)、AMPK 信號通路 (ko04152)、B 細胞受體信號通路 (ko04662)、內分泌和代謝疾病 (ko09167)、肥厚型心肌病 (ko05410)、基底細胞癌 (ko05217)、病毒性心肌炎 (ko05416) 等信號通路，這些通路均與疾病的發生發展密切相關。miR-433-5p 靶向MAP2K7、MAP3K4、FGFR3、SRF、HSPB1等基因調控MAPK 信號通路，而miR-433-5p 靶向SERPⅠNE1、SLC27A1、COL1A1、FZD8、PLCG1又調控內分泌和代謝疾病。let-7-5p靶向FZD5、TCF7L2、PLCB1、LRP5調控Wnt 信號通路，而let-7-5p 靶向DTX3、HDAC1、NCOR2、MAML3調控Notch 信號通路。 let-7-5p 靶向TCF7L2、FZD5和miR-125a 靶向DV11、miR-127-5p 靶向GLⅠ3、CTNNB1調控基底細胞癌的發生。這些特異表達的miRNAs可能是決定器官或組織不同表征和功能的重要因素之一。由此推測，林麝肝臟特異表達的miRNAs可能參與疾病的發生和發展的調控。