基于ICP-MS 技術分析不同產地鱉血無機元素差異

梁藝瑤，蘇雪蓉，婁 悅，謝 穎，崔小兵，李 錦，趙曉莉*

（1.南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫院 藥學部，江蘇 南京 210004）

鱉科動物中華鱉Trionyx sinensisWiegmann 是我國傳統的水產動物，全身營養豐富，可作藥食兩用。鱉血來源于中華鱉的新鮮血液，味咸、性寒，具有滋陰清熱、活血通絡之功效[1]?，F代研究表明，鱉血含有蛋白質、氨基酸、無機元素、酶類等活性物質，具有調節免疫及抗腫瘤等藥理活性[2-4]。鱉血作為中藥炮制的傳統輔料應用歷史悠久，主要用于銀柴胡、丹參、柴胡等飲片的炮制，有填血滋陰、抑制藥物浮陽之性，增強清肝退熱之效[5]。以鱉血拌銀柴胡，增強滋陰退熱除蒸之力[6]；以鱉血炮制丹參，增其清心養陰除煩之效[7]；以鱉血拌柴胡，防柴胡辛涼升散耗散肝陰[8]。

中華鱉在中國主要分布于湖南、江蘇、浙江等地，以人工養殖為主[9]。不同養殖地的土壤、水源、氣溫等因素可能會影響鱉血的無機元素含量。研究表明，鱉血中含有18 種無機元素，除了K、Na、Ca、Mg、P 等常量元素外，還含有人體必需的Fe、Zn、Cu、Mn 等微量元素，這些微量元素可促進激素合成，影響機體的生長發育，減少疾病的發生[8]。鱉血作為炮制輔料，其無機元素的含量會進一步影響炮制品的藥效[10]，目前尚未見有關鱉血無機元素的分布規律相關研究。

常用的無機元素分析方法有電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法、原子吸收分光光度法、紫外-可見分光光度法等[11-12]。ICP-MS 靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬，可快速、準確地檢測人血液中的十幾種元素[13]。由于鱉血取血量少，元素含量低，本研究選擇ICP-MS 測定不同產地鱉血中的18 種無機元素，并采用聚類分析和主成分分析方法進行多元統計分析，以期為鱉血的質量評價、安全性評價及綜合利用提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

OptimaTM 2100DV 型電感耦合等離子體-質譜儀（ICP-MS，美國Perkin Elmer）；MS-105 型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 藥品與試劑

硝酸（批號：20141119，優級純）、30% H2O2（批號：20141128，優級純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；多元素標準溶液（批號：GNM-M248430，100 mg/L）、混合內標溶液［鈧（Sc）、鍺（Ge）、鉍（Bi）、銦（In）］（批號：GNM-M041207，100 μg/mL）均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

12 批中華鱉經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為鱉科動物中華鱉Trionyx sinensisWiegmann，產地為江蘇省寶應縣、浙江省淳安縣、湖南省漢壽縣、浙江省余姚市。經斷頸法取血后，置于CPDA-1 血液保存液中，于4 ℃條件下貯藏，備用。鱉血樣品信息見表1。

表1 樣品來源信息Tab.1 Sample source information

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密量取適量混合內標溶液，用3% HNO3稀釋成濃度為100 μg/L 的內標溶液。精密量取多元素混合標準溶液，以3% HNO3配制成濃度分別為0、1、5、10、20、50、100、250、500 μg/L 的系列多元素混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取鱉血0.2 g，精密稱定，加入濃硝酸3 mL，30% H2O22 mL，消解12 h 至樣品澄清透明，加蒸餾水定容至500 mL。離心5 min（15 000 r/min），取上清液，備用。同法制備空白溶液。

2.3 ICP-MS 工作條件

高頻等離子體發射功率：1 500 W；檢測器電壓：1 700 V；載氣：高純氬氣；等離子體氣體積流量：17 000 mL/min；霧化氣體積流量：0.92 mL/min；碰撞氣體積流量：1.2 mL/min，引入內標溶液進行檢測。

2.4 方法學考察

2.4.1 工作曲線的制備及檢出限的測定 取“2.1”項下多元素混合對照品溶液在“2.3”項條件下進行測定，以各元素濃度（X，μg/L）為橫坐標，相應儀器響應值與內標測量值的比值（Y）為縱坐標，繪制工作曲線。取空白溶液，按“2.3”項下條件測定11次，以測定元素的信號響應值的標準偏差（δ）的3倍所對應的質量濃度為檢測限。線性回歸方程、相關系數（r）、線性范圍及檢測限見表2。

表2 18 種元素的線性回歸方程、相關系數、線性范圍及檢測限Tab.2 Regression equation, correlation coefficient, linear range and LOD of 18 elements

2.4.2 精密度試驗 取“2.1”項下配制的濃度為100 μg/L 的多元素混合對照品溶液，按照“2.3”項下條件連續進樣6 次，各元素質量分數的RSD 為0.55% ～ 4.21%，表明儀器具有良好的精密度。

2.4.3 穩定性試驗 取批號為BY1 的樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、0.5、1、2、3、4 h，按照“2.3”項下條件進樣測定，各元素質量分數的RSD 為1.76% ～ 9.22%，表明該方法穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取批號為BY1 的樣品，按照“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按照“2.3”項下條件分別進樣測定，各元素含量的RSD為0.14% ～ 9.15%，表明該方法重復性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取批號為BY1的樣品0.1 g，精密稱定，加入適量已知濃度的混合多元素對照品溶液，按“2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.3”項下條件分別進樣測定，各元素含量的回收率范圍為86.67% ～ 107.33%，表明該方法基本不受樣品基質干擾，準確度良好。

2.5 鱉血無機元素的分析

各取12 批鱉血樣品0.2 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下條件進行測定，計算各元素含量。12 批不同產地的鱉血樣品中Na 元素含量最高，其次為P、K、Fe、Mg 等元素，見表3。

表3 12 批不同產地鱉血無機元素含量（μg/g, n = 3）Tab.3 Contents of inorganic elements in 12 batches of Sanguis Trionycis from different producing areas（μg/g, n = 3）

2.6 無機元素特征圖譜分析

根據12 批鱉血中無機元素測定結果，采用GraphPad Prism 9 繪制鱉血無機元素特征圖譜（圖1）。為充分體現各元素貢獻，將所有元素擴大或縮小至同一數量級，即Cu、Mn、V、Ni、Sr、Sn 保持不變，Pb、As、Zn 擴大10 倍，Co 擴大5 倍，P、K、Fe 縮小100 倍，Mg、Ca、Zn、Si 縮小10 倍，Na 縮小1 000 倍。結果表明，四個產地鱉血無機元素整體特征基本一致，含量存在差異，這可能與不同中華鱉養殖基地的土壤、水質、溫度等有關。

圖1 四種產地鱉血的無機元素特征圖譜Fig.1 Characteristic spectra of inorganic elements in Sanguis Trionycis from four producing areas

2.7 聚類分析和主成分分析

2.7.1 聚類分析 采用IBM-SPSS 26 軟件，以12批鱉血中的18 種無機元素含量作為聚類變量，進行聚類分析，得系統聚類樹狀圖（圖2）。判別距離為15 時，12 批樣品被分為四類，BY1、BY2、BY4 聚為一類，BY3 聚為一類，HS1、HS2、HS3 聚為一類，YY1、YY2、CA1、CA2、CA3 聚為一類，即浙江省收集的鱉血聚為一類，可與湖南省和江蘇省兩地區分，表明不同產地鱉血的無機元素富集存在一定特征。

圖2 聚類分析譜系圖Fig.2 Cluster analysis pedigree diagram

2.7.2 主成分分析 采用IBM-SPSS 26 軟件對12批鱉血樣品中各元素含量數據進行標準化處理，進行主成分分析，主成分分析的特征值及方差貢獻率結果見表4。前4 個主成分的特征值分別為9.559、3.675、1.809、1.229，均大于1，方差貢獻率分別為53.10%、20.42%、10.05%、6.83%，表明這4 個成分能夠代表鱉血中絕大多數無機元素信息（圖3），因此，對前4 個成分的載荷矩陣進行深入分析。由表5 可知，第1 個主成分與Co、V、Fe、K、Sr 高度相關（相關系數＞0.9），第2 個主成分與Mn 呈正相關（相關系數＞0.9），第3 個主成分與Sn 呈正相關（相關系數＞0.8），第4 個主成分與Na 呈正相關（相關系數＞0.5）。前4 個主成分的累計方差貢獻率為90.40%，超過總方差的90%，因此Co、V、Fe、K、Sr、Mn、Sn、Na 被認為是鱉血的特征元素。

圖3 元素主成分載荷圖Fig.3 Element principal component load diagram

表4 鱉血主成分特征值及方差貢獻率Tab.4 Principal component characteristic values and variance contribution rate of Sanguis Trionycis

表5 鱉血主成分因子載荷矩陣Tab.5 Loading matrix of principal component factors of Sanguis Trionycis

以選取的主成分方差貢獻率為權重系數，以因子載荷值除以方差特征值開平方得到4 個主成分得分公式，分別為F1=0.317Z1-0.315Z2-0.310Z3-0.309Z4+0.308Z5+0.302Z6-0.290Z7-0.240Z8-0.213Z9-0.210Z10+0.204Z11+0.204Z12+0.051Z13+0.161Z14+0.206Z15+0.096Z16-0.003Z17+0.166Z18；F2=-0.008Z1+0.017Z2+0.043Z3+0.073Z4+0.142Z5-0.094Z6+0.073Z7+0.300Z8+0.195Z9-0.248Z10+0.214Z11-0.213Z12+0.476Z13+0.411Z14+0.370Z15+0.362Z16-0.088Z17+0.077Z18；F3=0.008Z1+0.146Z2-0.058Z3-0.010Z4-0.074Z5+0.144Z6+0.127Z7-0.118Z8+0.126Z9-0.025Z10+0.169Z11+0.357Z12+0.106Z13+0.121Z14+0.101Z15+0.249Z16+0.621Z17-0.513Z18；F4=0.142Z1-0.029Z2+0.158Z3+0.203Z4-0.052Z5+0.039Z6+0.234Z7+0.069Z8-0.209Z9+0.522Z10-0.253Z11-0.210Z12+0.090Z13+0.033Z14-0.090Z15+0.311Z16+0.388Z17+0.399Z18。 其 中，F1～F4為4 個主成分的得分，Z1～Z18為P、K、Na、Mg、Ca、Fe、Cu、Zn、Co、Mn、Si、V、Ni、Sr、Pb、As、Sn、Li 元素的標準化數據。按照公式F=0.531F1+0.204F2+0.101F3+0.683F4計算綜合得分F，見表6。12 批樣品中浙江省淳安縣和湖南省漢壽縣的鱉血綜合評分最高，證明在無機元素方面這兩個產地總體評價更好。

表6 不同產地鱉血主成分得分及綜合得分Tab.6 Main component score and comprehensive score of Sanguis Trionycis from different producing areas

3 討論

本研究采用ICP-MS 法測定全國4 個中華鱉養殖基地中鱉血的無機元素含量，并采用聚類分析和主成分分析探討無機元素分布規律?；?2 批鱉血樣品的18 種無機元素含量測定結果建立的特征圖譜顯示，不同產地鱉血的無機元素組成具有一致性，但含量存在一定差異。此外，聚類分析結果顯示，浙江收集的鱉血能聚為一類，可與湖南、江蘇兩地區分，提示不同的氣候和養殖環境造成了土壤和水質中元素的差異性，間接影響了中華鱉血液中元素的含量，即鱉血質量可能與不同產地相關。主成分分析結果表明Co、V、Fe、K、Sr、Mn、Sn、Na 為鱉血的特征元素。Co、V、Fe、Mn、Sn、Sr 均為人體必須微量元素，其中，Fe 作為鱉血中含量最高的微量元素，能參與氧氣運輸和物質代謝過程，改善人體造血功能，同時也與人體免疫系統關系密切[14]。Mn 是超氧化物歧化酶的主要成分之一，參與消除自由基、減緩衰老、提高機體免疫功能[15]。Co 作為維生素B12的組成部分，可以幫助血液中紅細胞和白細胞形成。V 在維持機體生長發育，促進造血功能，增加免疫力等方面有重要作用。常量元素K、Na 是機體中重要的電解質，可控制體液滲透壓和保持酸堿平衡[16]。以上元素所表現出的生理活性與文獻[2-3]報道的鱉血免疫調節作用相一致，因此可認為鱉血的這些特征無機元素是其作為炮制輔料的科學內涵。

4 結論

本研究建立了ICP-MS 法測定鱉血中18 種無機元素含量的方法，方法學考察表明其精密度、穩定性、重復性、準確度良好。聚類分析結果表明不同產地的鱉血無機元素特征圖譜組成基本一致，含量存在一定差異，且不同區域來源的鱉血能明顯區分。主成分分析結果表明，Co、V、Fe、K、Sr、Mn、Sn、Na 是鱉血的特征元素；浙江省淳安縣和湖南省漢壽縣的鱉血在無機元素方面綜合評價較優。本實驗建立的鱉血無機元素檢測方法快速、準確，為鱉血的質量評價、安全性評價及綜合開發利用提供重要參考。