人參多糖聯合槲皮素對DSS 誘導小鼠潰瘍性結腸炎的保護作用

饒 敏，孫智輝，馬占川，徐華麗，睢大筼，高普均

（1.吉林大學第一醫院，長春 130021；2.吉林大學藥學院，長春 130021）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種易反復發作的非特異性腸病，具有病程長、治愈難度大、易致癌的特點， 被世界衛生組織列為現代難治性疾病之一。目前治療主要包括非特異性抗炎和免疫抑制藥物[1]。 中藥可通過調節炎癥細胞因子、腸道菌群、免疫系統及保護腸黏膜來治療UC，相比西藥更安全，抗炎、調節免疫的效果更好[2]。

人參多糖（Ginseng polysaccharide，GPS）是五加科人參屬植物人參（Panax ginsengC.A. Mey.）成熟果實中最重要的活性組分之一， 主要成分為淀粉樣葡聚糖、RG-Ⅰ型果糖、HG 型果糖、AG 型果糖， 具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病等活性[3]。佟彤等人通過環磷酰胺免疫抑制模型和刀豆蛋白A 肝炎模型，研究了人參多糖對小鼠的免疫調節作用， 結果表明，人參多糖在兩種模型中均能發揮良好的免疫調節作用[4]。劉春紅課題組考察了人參多糖的免疫調節作用，研究了植物乳桿菌C88 與人參多糖的聯合作用，借助酶聯免疫吸附實驗對小鼠血清中IL-2、TNF-α 等相關生化指標進行了檢測，結果發現聯合用藥組表現出更明顯的免疫調節作用[5]。槲皮素（quercetin，QT）又名槲黃素、櫟精，屬黃酮類化合物，主要以苷的形式存在。 現代藥理研究表明，槲皮素可顯著增強環磷酰胺造成的免疫低下小鼠的免疫功能，可使外周血白細胞計數、脾指數、T 淋巴細胞增殖率均升高，CD4 比例及CD4/CD8 比值升高，淋巴細胞凋亡比率降低[6]。 槲皮素可有效保護系統性紅斑狼瘡模型小鼠的腎臟功能，并改善其免疫功能[7]。 那么，GPS 與QT 的免疫調節及抗炎活性是否對UC 具有協同治療作用呢？ 本文建立DSS 誘導的小鼠潰瘍性結腸炎模型，觀察二者聯合應用的協同作用，為其開發利用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 動物

Balb/c 小鼠，雄性，體重20～22g，由遼寧長生生物技術股份有限責任公司提供， 質量合格證號：SCXK-（遼）2020-0001。

1.2 藥品及試劑

人參多糖由東北師范大學生命科學學院提供，批號：20200510，以雙蒸水配制成所需濃度；槲皮素由吉林大學化學學院提供，純度>98%，批號：20221025，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成所需濃度；柳氮磺吡啶由上海福達制藥有限公司提供， 批號：20221010，以0.5% CMC-Na 配制成所需濃度；MDA、SOD、CAT、GSH-Px、IL-6、IL -1β、IL -18、IFN -γ 及TNF-α 測試盒均由南京建成生物工程研究所提供，批號：20230315。

1.3 實驗方法

50 只雄性Balb/c 小鼠隨機分為對照（Con）組，模型（DSS）組，人參多糖（GPS）聯合槲皮素（QT）低、高劑量組及陽性藥柳氮磺吡啶（SASP）組，每組10 只。 除對照組外， 各組小鼠自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（DSS） 造模，GPS+QT 低、 高劑量組分別先后灌胃GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg，SASP 組灌胃SASP 500 mg/kg，Con 組與DSS 組灌胃等量0.5% CMC-Na，灌胃體積均為20 mL/kg，每天2 次，連續7 天。 于造模7 天后腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉， 處死小鼠，取結腸組織HE 染色觀察結腸病理變化；ELISA試劑盒檢測結腸組織白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-18（IL-18）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量；生化試劑盒檢測結腸組織超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量。

1.4 統計處理與數據分析

2 結果

2.1 對小鼠結腸組織病理形態學的影響

結腸組織HE 染色結果顯示，Con 組隱窩結構完整清晰，無炎癥細胞浸潤。 DSS 組結腸組織廣泛深度損傷，可見隱窩扭曲，炎癥細胞浸潤增加，部分出現結腸黏膜及黏膜下層侵蝕和潰瘍。GPS+QT 50+50 mg/kg劑量組炎癥細胞浸潤減少，部分隱窩結構完整。 GPS+QT 100+100 mg/kg 劑量組和SASP 500 mg/kg 組小鼠結腸浸潤性炎癥細胞明顯減少，結腸炎嚴重程度顯著降低，結果見圖1。

圖1 對小鼠結腸組織病理形態學的影響（HE 染色）

2.2 對小鼠結腸組織炎癥相關細胞因子的影響

與Con 組比較，DSS 組結腸組織IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ 及TNF-α 含量均明顯升高 （P＜0.01）；與DSS 組比較，GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg 劑量組及SASP 500 mg/kg 組均能明顯降低結腸組織IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ 及TNF-α 含量 （P＜0.05 或P＜0.01），結果見表1。

表1 聯合用藥對小鼠結腸組織炎癥相關細胞因子的影響（±s，n=10）

與對照組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 對小鼠結腸組織氧化應激相關指標的影響

與Con 組比較，DSS 組小鼠結腸組織SOD、CAT及GSH-px 活性均明顯降低，MDA 含量明顯增加（P＜0.01）；與DSS 組比較，GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg劑量組及SASP 500 mg/kg 組小鼠結腸組織SOD、CAT及GSH-px 活性均明顯增加（P＜0.05 或P＜0.01），MDA含量明顯減少（P＜0.05 或P＜0.01），結果見表2。

表2 聯合用藥對小鼠結腸組織氧化應激相關指標的影響（±s，n=10）

表2 聯合用藥對小鼠結腸組織氧化應激相關指標的影響（±s，n=10）

與對照組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

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3 討論

DSS 是誘導結腸炎的常用方法，腸道炎癥的嚴重程度可通過改變DSS 濃度和給藥頻率加以調整。C57BL/6 品系小鼠造模的DSS 劑量通常為1.5%至3.0%，BALB/c 品系小鼠造模的DSS 劑量通常為2.5%和5.0%[8]。 本文選擇通過小鼠自由飲用3%的DSS 水溶液制作UC 模型，時間長度為7 天[9]。 據報道，雄性鼠更容易發生無上皮化的潰瘍[10]，本文采用雄性鼠作為實驗動物。

與健康人相比，UC 患者腸黏膜有不同程度的潰瘍，炎癥細胞浸潤增加，固有層淺表部分有漿細胞、T淋巴細胞、B 淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞的浸潤，隱窩出現炎癥變化，隱窩膿腫數量增加。 隨著疾病進展，炎性細胞浸潤從固有層淺部擴散到結腸深層，隨后累及整個腸道組織，所有細胞浸潤趨勢增加[11]。 本實驗結果顯示，DSS 組小鼠結腸組織出現廣泛深度損傷，可見隱窩扭曲，炎癥細胞浸潤增加，部分出現結腸黏膜及黏膜下層侵蝕和潰瘍。 GPS與QT 聯合應用可使結腸浸潤性炎癥細胞明顯減少，結腸炎嚴重程度顯著降低，表明可保護結腸組織的病理性損傷。

UC 造成結腸組織損傷的原因之一是過度激活的炎癥反應。高表達的細胞因子介導了炎性細胞和非免疫細胞之間的病理性互相作用，促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 與抗炎因子之間的失衡是結腸炎致病原因之一[12]。 疾病狀態下，共生菌群衍生的脂多糖會導致中性粒細胞浸潤， 進一步產生大量的IL-1β，以依賴性方式誘導腸道單核吞噬細胞產生IL-6[13]，IL-6 在DSS 誘導的結腸炎小鼠中升高最為顯著，對下游酶及其他通路有調節作用，IL-6 和TNF-α 會導致結腸炎進一步發展[14]。 臨床數據證明，腸道中IFNγ 水平增加對腸道有致病作用[15]。 IL-18 的釋放可以介導杯狀細胞損失以誘導結腸炎發展， 并干預T 細胞介導的結腸炎[16]。 本實驗結果顯示，DSS 組小鼠結腸組織IL-6、IL-1β、IL-18、IFN-γ 和TNF-α 含量顯著升高，GPS 與QT 聯合應用可使結腸組織上述炎癥因子含量明顯降低，表明可通過調節炎癥細胞因子減少結腸組織的損傷。

UC 造成結腸組織損傷與氧化應激密切相關，體內抗氧化酶SOD、CAT 及GSH-Px 等在UC 發生發展中起重要作用[17]。 本實驗結果顯示，DSS 組小鼠結腸組織MDA 含量明顯上升，SOD、CAT 及GSH-Px 活性明顯下降，GPS 與QT 聯合應用可使結腸組織MDA含量明顯下降，SOD、CAT 及GSH-Px 活性明顯上升，表明可通過對抗氧化應激損傷保護結腸組織。