經典名方溫膽湯指紋圖譜研究

付成國，張 穎，張美琪，李 雙，高 嵩，徐 建，鄢必新

（吉林修正藥業新藥開發有限公司，吉林省中藥標準化關鍵工程技術重點實驗室·吉林 長春·130103）

溫膽湯出自唐代孫思邈《備急千金要方》，方曰：“治大病后，虛煩不得眠，此膽寒故也，宜服此溫膽湯方”[1]。 該方由清半夏、竹茹、麩炒枳實、陳皮、生姜、炒甘草共6 味藥材組成。 傳統功能主治脾胃不和，痰熱內擾之虛煩不眠，或嘔吐呃逆，或驚悸不寧可等癥?，F代研究表明其對神經系統、心血管系統、消化系統和呼吸系統等疾病均有一定的療效[2]。中藥指紋圖譜可以科學、系統、全面地反應中藥的復雜化學成分組成[3]，指紋圖譜技術應用日益廣泛，不僅應用于中藥的含量測定，還是對中藥已知成分和未知成分進行整體評價和分析的質量控制方法。 指紋圖譜技術已經成為中藥材和制劑控制質量的重要手段之一。 有關溫膽湯指紋圖譜的研究報道較少[4]，本文通過HPLC 法建立了10 批溫膽湯的指紋圖譜，并采用相似度評價軟件，客觀地反映了溫膽湯化學成分的整體性、復雜性及質量差異，為溫膽湯的物質基礎研究提供了實驗依據[5-8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安U3000 高效液相色譜儀， 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；MS105DU 型電子天平，梅特勒-托利多公司；TOLEDO XPR2 型百萬分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；SB25-12DT 型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試劑與試藥

1.2.1 試藥

溫膽湯樣品 （批號：230101 ～230105；230201 ～230205），均由修正藥業集團股份有限公司提供；甘草苷（批號：111610-201607）、 柚皮苷（批號：110722-202116）、蕓香柚皮苷（批號：2014-0025）、橙皮苷（批號：110721-202019）、 新橙皮苷 （批號：111857-201804）、甘草酸銨（批號：110731-201418）、6-姜辣素（批號：111833-202007），中國食品藥品檢定研究院。

1.2.2 試劑

乙腈為色譜純；甲醇、甲酸、磷酸，均為分析純；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB C18色譜柱 （柱長為250mm，內徑為4.6mm，粒徑為5μm )；以乙腈為流動相A，以0.3%磷酸溶液為流動相B，按下表中規定進行梯度洗脫；檢測波長為237nm；柱溫為25℃；流速1ml/min，進樣量為10μL。 理論板數按柚皮苷峰計算應不低于10000。

時間（分鐘）流動相A（%）流動相B（%）0～1412→2088→80 14～1520→1580→85 15～191585 19～2015→2085→80 20～352080 35～5020→7280→28 50～6072→1228→88

2.2 對照品溶液的制備

取甘草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素，精密稱定，分別加甲醇制成每lml 含20μg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取溫膽湯樣品1g， 置具塞錐形瓶中， 精密加入50%甲醇15ml， 稱定重量， 超聲處理30 分鐘 （功率250W，40KHz），放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察[9-10]

2.4.1 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下的供試品溶液10μL，按照“2.1”項下的色譜條件和指紋圖譜測定方法，連續進樣6 次，進行測定，記錄指紋圖譜數據，選取柚皮苷作為參照峰（S 峰），計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，分別考察其RSD 值，結果相對保留時間RSD均小于0.5%，相對峰面積RSD 均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗

取同一批供試品（批號：230204），按“2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，選取柚皮苷作為參照峰（S 峰），計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積。 分別考察其RSD值，結果相對保留時間RSD 均小于0.5%，相對峰面積RSD 均小于5.0%，表明該方法的重復性較好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 參照物選擇

指紋圖譜的參照物主要用于考察指紋圖譜的穩定性和重現性，并有助于色譜峰的辯認，起著辯認和評價色譜指紋圖譜共有峰的指引作用。在溫膽湯指紋圖譜色譜圖中，因柚皮苷峰（7 號峰）其保留時間適中，峰面積較大，分離度較好，所以選為參照峰（S 峰）。

2.5.2 共有模式的建立

取10 批溫膽湯樣品， 批號分別為 （230101－230105；230201－230205），分別進行檢測，結合重復性試驗結果，去除相對峰面積較小、峰形不佳等易受影響，導致檢測結果不穩定的色譜峰。將10 批樣品測定指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，經多點校正，將色譜峰匹配，生成對照圖譜，確定15 個指紋峰。 10 批樣品指紋圖譜相似度均大于0.9。 其相對保留時間和相對峰面積結果分別見表1 和表2。

表1 10 批樣品相對保留時間考察結果

表2 10 批樣品相對峰面積考察結果

2.5.3 峰指認

取甘草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸銨、6-姜辣素適量，精密稱定，分別用甲醇制成每lml 含20μg 的溶液，依法測定。 通過上述對照品色譜峰進行指認。結果表明，峰4 為甘草苷、峰5 為蕓香柚皮苷、峰7 為柚皮苷、峰8 為橙皮苷、峰9 為新橙皮苷、峰12 為甘草酸銨、峰13 為6-姜辣素。

3 結論

建立了溫膽湯指紋圖譜測定方法， 確定了15 個指紋峰，分別指認了7 個指紋峰。 建立的指紋圖譜方法能有效表征溫膽湯的質量情況，是成品質量控制方法的提升和完善，能全面有效地控制產品質量，結果見圖1。

圖1 10 批溫膽湯指紋圖譜疊加圖及其對照指紋圖譜（R）

4 討論

在不同檢測波長[11]（237nm、257nm、283nm、327nm）下分別進樣檢測， 分析后發現在237nm 時色譜峰出峰較多， 各峰比例和峰型較佳， 分離度好， 故選擇237nm 作為檢測波長進行后續檢測。 分別考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.3%磷酸水等流動相梯度洗脫系統，結果表明，以乙腈-0.3%磷酸水為流動相梯度洗脫，色譜峰基線噪音小，峰型好，分離效果最佳，確定乙腈-0.3%磷酸水為流動相。實驗中10 批樣品的批號分別為（230101－230105；230201－230205），在10 批樣品中，15 個共有峰中未標定的成分， 有待進一步采用對照品或液-質聯用技術進一步分析確定，為后續建立經典名方溫膽湯的質量控制標準及藥效物質基礎研究提供參考[12-13]。