小兒柴桂退熱口服液治療冠狀病毒感染的網絡藥理學研究

劉 佳，曹文軒，黃 劍，秦瑞瞳，李麗靜，于 澎

（1.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117；2.東北師范大學藥物基因和蛋白篩選國家工程實驗室，長春 130117；3.華東理工大學生物工程學院，上海 200237）

冠狀病毒（Coronaviruses, CoVs)是廣泛存在于自然界的是一種有包膜的單鏈RNA 病毒，被國際病毒學分類委員會分為α、β、γ 和δ，共4 個屬[1]。 冠狀病毒的廣泛分布，人—動物轉化和基因材料的頻繁重組可能是導致冠狀病毒在人類中頻繁和周期性出現的原因[2-4]。 作為一種人畜共患病毒，它極大的威脅了人類和動物的安全。 目前已明確7 種CoVs 可使人類感染， 包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV 和SARS-CoV-2[5]。 其中2002年的SARS - CoV 和2019年肆虐全球的SARS-CoV-2 的感染人數和死亡人數令人痛心。

研究表明，1～3 歲的幼兒是冠狀病毒的感染重災區，但多為輕癥，主要為呼吸道感染，也存在肺外表觀。 其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1 每年均會引起大量感染，且兒童感染頻率高于成人[6,7]。也有報道稱HCoV-HKU1 可能誘發幼兒急性哮喘的發作[8]。 自SARS- CoV-2 感染爆發至2022年大部分地區實施常態化管理后， 兒童感染后多系統炎癥綜合征導致病癥較明顯，因此不能忽視兒童感染CoVs 所帶來的潛在風險[9]。

中醫藥在防治CI 的工作中扮演著重要的角色，結合冠狀病毒所引發的致病特點和臨床癥狀，CI 病灶主要集中在肺部，屬于“瘟病”范疇，以“濕、熱、毒、瘀、虛”為主要病機[10]。 小兒柴桂退熱口服液（Xiaoer Chaigui Tuire Oral Liquid，XCTOL）是近年來在臨床應用較多的一種純中藥制劑，該藥物對SARS-CoV-2 變異株兒童感染者引起的發熱、頭痛、咳嗽，黃鼻涕等癥狀效果良好[11,12]。 臨床研究表明，XCTOL 能有效對抗病毒感染，提高機體抵抗力，增加合并用藥的治療效果，縮短臨床治療時間[13]。

網絡藥理學被認為是一種用于探究中藥復方作用機制和開發新藥的創新方式[14]。 分子對接技術也是新藥結構分子生物學和計算機輔助藥物設計的重要途徑。 本研究利用網絡藥理學和分子對接技術探究XCTOL 中的活性化合物，預測其對抗CI 的潛在機制，探索其活性化合物與關鍵作用蛋白的對接關系[15,16]。結合對XCTOL 以往的研究， 本文將應用網絡藥理學結合分子對接的方法探討XCTOL 對CI 的治療靶點以及起到治療效果的主要成分。

1 資料與方法

1.1 XCTOL 活性成分篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[17]（TCMSP，https://tcmsp-e.com/）對XCTOL 中所含中藥進行對應活性成分檢索，包括柴胡、桂枝、葛根、浮萍、黃芩、白芍、蟬蛻。 以口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)0.18 作為篩選條件，構建XCTOL 活性成分數據庫。

1.2 XCTOL 活性成分靶點預測

利用Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫對XCTOL 組方中活性成分化學信息進行檢索，從中獲得SMILE 號，將SMILE 號導入SwissTarget Prediction 靶點預測平臺，設置種屬為“homo sapiens”，進行靶點預測，將得到的靶點進行整合和去重處理。

1.3 冠狀病毒疾病靶點檢索

以“Coronavirus”為檢索關鍵詞，利用Genecard 數據庫對冠狀病毒疾病靶點進行檢索，將得到的靶點進行整合和去重處理。

1.4 交集靶點篩選及Venn 圖繪制

在Venny2.1.0 平臺分別錄入XCTOL 和CoVs 的對應靶點，得到兩者的交集，作為XCTOL 治療CoVs的潛在作用靶點，并將其進行可視化處理。

1.5 中藥-成分-靶點網絡構建

將XCTOL 中活性成分及其預測的靶點、 疾病靶點和中藥分別導入Cytoscape3.7.2 軟件中， 構建 “中藥-成分-靶點”網絡，并進行可視化處理，其中中藥、活性成分、靶點交集和非靶點交集分別用不同的形狀和顏色表示。

1.6 蛋白-蛋白相互作用網絡（PPI）構建

將XCTOL 與CoVs 的交集靶點輸入至STRING（https://cn.string-db.org/） 平臺， 設置種類為“Homo sapiens” 獲取蛋白相互作用信息。 將作用結果導入至Cytoscape3.7.2 軟件中進行可視化處理并進行拓撲分析，根據Degree 值的大小進行排序，篩選出核心靶點。

1.7 富集分析

選取XCTOL 與CoVs 的交集靶點， 利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/） 數據庫對其進行GO（gene ontology）和KEGG 通路分析，分析XCTOL 抗CI 的生物過程和信號通路。

1.8 分子對接分析

利用Pubchem 數據庫下載XCTOL 中活性化合物SDF 格式的3D 結構，利用Open Babel 軟件將其轉換為pdb 格式。 利用PDB（https://www1.rcsb.org/）數據庫檢索并下載蛋白質小分子的晶體結構， 運用Autodock 1.5.6 軟件分別對化合物及靶蛋白進行加氫及加電荷處理，保存為pdbqt 格式。 將保存后的靶蛋白作為受體，化合物作為配體，在Autodock 1.5.6 軟件進行分子對接， 對接的結果以結合能Binding Energy給出，以pdbqt 格式保存，Pymol 軟件將結果進行可視化。

2 結果

2.1 XCTOL 活性成分篩選

通過數據庫檢索和篩選得到XCTOL 中活性化合物共74 個（共有成分4 個），其中柴胡13 個，桂枝3個，葛根4 個，浮萍6 個，黃芩32 個，白芍8 個，蟬蛻8 個。 XCTOL 中部分活性化合物基本信息見表1。

2.2 “中藥-成分-靶點”網絡構建與分析

該網絡共有975 個節點， 其中包含7 個藥物節點、79 個活性成分節點和889 個靶點節點，共有7332條邊。其中中心圓形代表藥物，外周圓形代表化合物，青色方形代表靶點，紅色方形代表共有成分，每條邊表示節點之間的相互作用關系，詳見圖1。 對構建后的網絡進行拓撲分析，結果表明，包括β-谷甾醇、槲皮素、谷甾醇、山奈酚和芍藥苷在內的60 種活性化合物的Degree 值大于100，說明這些化合物與超過100個疾病靶點之間形成相互作用， 這些可能是XCTOL作用與新冠病毒的主要物質基礎。隨后對網絡圖進行拓撲分析， 根據Degree 值排名篩選出排名前五的化合物，作為關鍵化合物。

圖1 XCTOL-活性成分-靶點網絡

2.3 XCTOL 治療COVID-19 的潛在作用靶點

通過Genecard 數據庫檢索到冠狀病毒相關靶點1650 個， 與XCTOL 靶點進行映射后獲得交集靶點169 個， 以上結果運用Venny 平臺進行可視化處理，詳見圖2。

圖2 XCTOL-冠狀病毒作用靶點示意圖

2.4 蛋白-蛋白互作網絡分析

PPI 網絡圖顯示該網絡共有136 個節點和1874條邊，平均Degree 值為27.55，圖中節點大小與Degree值成正比關系，節點的Degree 值越大，圖中顯示的節點越大。 Degree 值代表了蛋白與蛋白之間作用的強弱，作用較強的蛋白可能在生物學功能中發揮著重要作用。 其中PPI 網絡中Degree 值排名前5 的蛋白為腫瘤壞死因子（TNF）、血清白蛋白（ALB）、腫瘤抑制蛋白p53（TP53）、胱天蛋白酶3（CASP3）和血管內皮生長因子A（VEGFA），這些靶蛋白可能是XCTOL 發揮抗冠狀病毒作用的關鍵靶點，詳見圖3。

圖3 XCTOL 治療冠狀病毒的靶點PPI 網絡

2.5 富集分析

通過DAVID 數據庫對XCTOL 與CoVs 交集靶點進行富集分析， 選取富集顯著性排名前10 的GO 分析結果進行整理， 包括BP、MF 和CC 條目共30 個，詳見圖4。其中BP 主要涉及調控蛋白質磷酸化、正向基因表達、 炎癥反應和DNA 損傷的內在凋亡信號等過程；CC 主要定位于細胞質、細胞膜、細胞外間質、細胞表面和胞質核周區等位置；MF 主要涉及調控蛋白結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、酶結合、ATP 結合及蛋白激酶活性等方面。

圖4 GO 生物功能分析

通過DAVID 數據庫對XCTOL 與冠狀病毒交集靶點進行KEGG 通路富集分析， 選取P 值排名前20的通路進行整理和分析，詳見圖5。 主要富集在HIF1信號通路、PI3K-Akt 信號通路、VEGF 信號通路、TNF信號通路、流感和肝炎病毒等信號通路。

圖5 KEGG 通路分析

2.6 分子對接分析

選取XCTOL 中關鍵化合物分別與PPI 分析中的關鍵靶點進行分子對接，結合能（Binding Affinity）小于0 說明化合物與靶蛋白之間具有對接活性，選取對接活性最佳的化合物和蛋白對接結果進行可視化分析， 詳見圖6。 小分子beta-sitosterol (β-谷甾醇)和stigmasterol（豆甾醇）與配體蛋白的對接活性高于其他小分子。

圖6 分子對接能量熱圖和分子蛋白之間詳細對接位點（C1:beta-sitosterol ;C2:kaempferol;C3:paeoniflorin;C4:quercetin;C5:stigmasterol）

3 討論

CoVs 是自然界中存在較為廣泛的一類病毒，研究表明CoVs 會導致人和動物的呼吸道、 消化道和神經系統相關疾病[18]。 當細胞遭受HCoV-229E 病毒感染后，幾乎會出現細胞因子風暴相關炎性因子大量分泌現象，進而出現病毒感染癥狀[19]。 CoVs 入侵細胞還可能會“劫持”自噬途徑，利用自噬膜結構特點促進自身復制，加劇CI 癥狀[20]。 其中不同類人群感染CoVs的嚴重程度亦有區分， 例如新生兒和有基礎病感染SARS-CoV-2 的重癥率、死亡率更高[21]，兒童相比于成人感染HCoV-229E 有可能引起嚴重的呼吸道感染癥狀[22]。 但是，并不是所有的藥物都適用于兒童，例如美國FDA 在2021年先后批復包括巴尼韋單抗、埃特司韋單抗等在內的用于預防或治療SARS-CoV-2 的藥物[23]，目前只能用于部分成人及12 歲以上的兒童。目前，中醫藥治療CI 在全國各地得到了廣泛應用，例如XCTOL 作為純中藥制劑， 用于治療流感病毒導致的肺炎等癥，值得深挖和推廣。

本研究從XCTOL 中篩選出5 個關鍵活性成分—β-谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）、槲皮素 （quercetin）、 山奈酚 （kaempferol） 和芍藥苷（Paeoniflorin）。 利用分子對接技術將以上關鍵成分與PPI 分析中的關鍵靶點蛋白進行對接，結果表明β-谷甾醇和豆甾醇與靶蛋白的親和力較強。 這提示β-谷甾醇和豆甾醇可能在XCTOL 治療CI 中發揮重要作用。 β-谷甾醇和豆甾醇同屬于植物甾醇—一類曾被譽為“生命鑰匙”的天然產物，具有抗氧化，免疫調節和抗炎作用等[24]。 其中，β-谷甾醇可以通過抑制炎癥小體NLRP3 的激活抑制casp1 的產生以及MAPK 信號通路的激活，從而抑制TNF-α，白介素-1β，6，8 的分泌起到抗炎作用[25]。 豆甾醇可以抑制多種炎癥介質和基質的降解， 通過阻礙IL-1β 誘導的NF-κB 通路來發揮其抑制炎癥， 還可以明顯減少炎癥環境中COX-2 和iNOS mRNA 的表達發揮抗炎作用[26,27]。

KEGG 通路分析顯示，XCTOL 與CI 共有靶點主要富集在HIF1 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、VEGF信號通路、TNF 信號通路、 流感和肝炎病毒等信號通路。 HIF-1 信號通路參與不依賴O2的能量生產和血管生成(如VEGF)及紅細胞生成，從而增加組織的氧氣輸送[28,29]。 CI 患者通常表現出B 淋巴細胞水平降低，這可能與HIF-1 激活有關[30]。 缺氧和HIF-1 信號的激活削弱了IgG 抗體的產生， 同時HIF-1α 操作B細胞Ig 同型變異， 影響了二次免疫的過程， 導致SARS-CoV-2 患者免疫過程受阻[31]。 PI3K-Akt 信號通路在調控炎癥細胞激活和傳遞素釋放過程中起重要作用，是呼吸道慢性炎癥發生過程中的關鍵調節路徑[32]。有研究表明，SARS-CoV-2 刺突通過細胞內ROS 抑制的PI3K/AKT/mTOR 軸誘導自噬， 進而導致受感染細胞的炎癥反應和凋亡[33]。 VEGF 是一種強有力的血管通透性因子， 在SARS-CoV-2 感染的肺組織中誘導血管滲漏，導致血漿外滲和肺水腫，進一步加劇組織缺氧[34,35]。有研究表明，SARS-CoV-2 患者的尸檢中發現感染的肺泡組織中存在大量的外滲物質[36,37]，重癥患者體內VEGF 水平顯著升高[38]， 這提示發生了VEGF 誘導的嚴重血管效應。在SARS-CoV-2 誘導的細胞因子中，TNF-α 通過誘導炎癥細胞死亡，在損傷重要器官中發揮作用。 臨床研究表明抑制TNF 信號通路不會導致病毒的重復感染，這對患者而言是有益的[39]。

PPI 網絡分析結果顯示，除TNF 和VEGFA 之外，血清白蛋白（ALB）、腫瘤抑制蛋白p53（TP53）、胱天蛋白酶3（CASP3）作為XCTOL 發揮治療COVID-19作用的關鍵靶基因也參與了調控過程。ALB 約占血清總蛋白的50%，其參與自由基清除、維持膠體滲透壓的生物過程，是與營養狀況和全身炎癥反應密切相關的一項指標[40]。 同時ALB 是預測CI 嚴重程度的一項重要指標，當出現病毒感染時，患者基礎代謝率較高，肝功能受損導致ALB 的合成受阻，ALB 表現出水平降低[41]。 TP53 基因與癌癥的發生和發展密切相關，幾乎所有的癌癥都具有TP53 基因異常這一共同特征，其實質是基因突變[42]。 有研究表明，TP53 基因對豬的SARS-CoV-2 相關蛋白ACE2 受體蛋白具有組織和性別特異性調控作用[43]，同時有研究報道TP53 通過ACE2 在人體內降解抑制冠狀病毒的復制， 并在豬的冠狀病毒感染中可抑制豬體內干擾素介導的抗病毒免疫[44]。 CASP3 由啟動因子caspase 激活，活化的CASP3催化許多細胞蛋白，在DNA 斷裂、核坍塌、染色質凝聚等過程中發揮作用[45]。CI 患者由于病毒感染激發的氧化應激增加活性氧(ROS)的產生[46]，高水平的ROS產生可能啟動細胞凋亡過程[47]，CASP3 會參與這一過程。XCTOL 以多靶點和多通路的方式調控CoVs 入侵機體后的多個生物過程，這可能是其發揮作用的潛在分子機制，也是未來相關藥物設計開發的切入點。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學和分子對接技術相結合的手段， 篩選XCTOL 中活性成分與關鍵靶蛋白相互作用的關鍵活性成分和信號通路，表明其可能通過調控炎癥反應和細胞間信號轉導等過程控制病毒的進一步侵染，具有多成分組合與調控多種途徑的特點。 本研究為XCTOL 應用于兒童感染CoVs 的治療和臨床推廣提供了理論基礎。