pH 和菲協同效應對中華絨螯蟹幼蟹的毒性效應

楊志剛，江青青，房余程，陳阿琴，成永旭，王愛民

1.上海海洋大學/農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306

2.上海海洋大學/農業農村部魚類營養與環境生態研究中心，上海 201306

3.上海海洋大學/水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306

4.鹽城工學院 海洋與生物工程學院，江蘇 鹽城 224000

水體pH 是水生動物生長存活的重要環境因子[1]，其波動可以對水生動物的組織形態、代謝及基因表達產生直接影響[2]。相關研究指出魚類長時間暴露于低pH 水體，會造成糖原分解變慢、糖異生途徑降低及肝糖原得不到及時補充[3]。

多環芳烴化合物 (Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs) 是水環境中廣泛存在的持久性污染物[4]。其在水體環境、河口沉積物中，甚至水生生物中已被大量檢出[5]，如太湖 (877～5 730 ng·g-1) 和鴨綠江沉積物 (68～1 500 ng·g-1)。高度城市化和工業化地區的PAHs 污染水平較高，例如珠江 (1 434～10 811 ng·g-1) 和澳門內港 (294～12 714 ng·g-1)[6-8]。已有研究證實PAHs 對多種水生動物具有明確的毒性作用[9-10]。菲 (Phenanthrene,PHE) 等PAHs 污染物進入機體后，可直接作用于多環芳烴受體 (AHR)，進而轉移至細胞核，與芳香烴受體核轉位因子 (ARNT) 結合，AhR/ARNT的復合物進而促進細胞色素p450 1A1 (cyp1a1) 基因的表達[11]，產生一些高度致癌性中間產物，最終導致細胞凋亡等[12-13]。

對于甲殼動物而言，其脂肪常常存儲在肝胰腺的R 細胞中[14]。中華絨螯蟹 (Eriocheirsinensis) 是一種主要在長江流域養殖的重要經濟品種，“蟹黃”的質量是消費者重點關注的食用品質，其中含有大量的脂肪和膽固醇[15-16]，而脂肪是重要的能量物質，因此能量代謝對于中華絨螯蟹而言十分重要。在現代養殖條件下，水生動物由于環境因素的變化更容易發生脂質代謝的變化[17]。隨著天氣和養殖密度等因素的變化，水體pH 也會隨時發生改變，且中華絨螯蟹作為典型的底棲生物，其生活在水體地表沉積物表面，非常容易接觸到PHE 和低pH 環境，在生產中若發生兩者聯合作用，會對養殖造成損失。為探究pH 和PHE 復合脅迫的毒性作用機制，本實驗測定了不同pH 下PHE 進入中華絨螯蟹機體后，對其重要的呼吸器官鰓和代謝器官肝胰腺的損傷情況，以及對能量代謝主要場所肝胰腺中相關生化指標及基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

中華絨螯蟹 [(15.0 ± 2.3) g] 采集自上海崇明，運送到上海海洋大學實驗基地進行相關實驗。實驗開始前，所有的蟹均在含有碳過濾自來水 [溶解氧質量濃度8.0～8.5 mg·L-1、pH 7.8、溫度 (20±2) ℃] 的脫氯水族箱 (100 cm×60 cm×50 cm) 中進行為期1 周的馴化適應，水箱中間均放置幾個長形拱狀瓦片作為隱蔽物。期間每2 d 投喂1 次商業飼料(浙江澳華公司)，每天用虹吸法吸取多余餌料，每2 d進行1 次水體更新。

1.2 pH 和PHE 暴露實驗建立

為研究低pH 和PHE 的聯合效應，建立了階乘設計：3 個pH 分別為5.5、6.5 和7.8 (5.5 為重度酸化，6.5 為中度酸化，7.8 為對照)，2 個PHE 質量濃度 (0 和50 μg·L-1)，分別為對照組pH 7.8×PHE 0，處理組pH 7.8×PHE 50、pH 6.5×PHE 0、pH 6.5×PHE 50、pH 5.5×PHE 0、pH 5.5×PHE 50。酸化條件根據有關的研究和整個酸化環境的預測[15,18]設定。將PHE 按照0.02% (質量分數) 溶解在二甲亞砜(DMSO) 中，配制成1 mg·L-1的母液，在DMSO 體積分數為 0.01%的情況下，向PHE 處理組中加入適量PHE 母液以達到目標PHE 質量濃度 (50 μg·L-1) 。實驗中PHE 質量濃度 (50 μg·L-1) 的設置是參考蝦蟹相關實驗[18]和中國湖泊環境中的實際濃度[19]，pH 的設定是基于本實驗室的研究基礎以及深度酸化的探討[17]。健康蟹隨機分組 (每組3 個重復，每個重復10 只蟹)。實驗期間，使用便攜式pH 計(HQ40D，美國Hach) 每4 h 檢測1 次水體pH，用1 mol·L-1NaOH 和1 mol·L-1HCl 調節pH。每2 d 更換1 次脅迫水體，以保持實驗性PHE 濃度。實驗持續14 d，期間持續充氧，每周飼喂2 次商業飼料。

1.3 樣品采集

實驗14 d 后，對中華絨螯蟹進行4 ℃低溫麻醉，而后每池取3 只蟹解剖采集鰓和肝胰腺，分別置于固定液中保存用于顯微結構的觀察，另外再采集3 只中華絨螯蟹肝胰腺置液氮速凍，-80 ℃保存待測。

1.4 實驗方法

1.4.1 組織染色與觀察

從不同的實驗組中各采集3 只中華絨螯蟹，迅速取出肝胰腺和鰓組織，樣品置于Bouin 氏液里固定24 h，經體積分數為70%、80%、95%、100% 梯度乙醇脫水，然后用二甲苯透明，石蠟包埋，使用手搖式切片機切片，厚度約為5 μm，最后用蘇木精和伊紅進行常規HE 染色，顯微鏡觀察并拍照 (Leica TCS SP8，德國) 。

1.4.2 能量代謝指標的測定

肝胰腺樣品以無水乙醇作為勻漿介質，經冰浴勻漿，離心提取上清后按試劑盒 (南京建成) 說明書測定甘油三酯(TG)、糖原 (Gly)、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C) 和低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)。

1.4.3 基因表達的測定

使用TRIozl 法對肝胰腺樣本進行RNA 的提取，使用HiScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) (南京諾唯贊) 對RNA 進行反轉錄生成cDNA，根據已報道的相關基因序列設計引物 (表1) 用于熒光定量PCR 檢測。SYBR?PCR Kit (南京諾維贊) 用于熒光定量PCR 反應，反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s?；?-??Ct方法，分析基因的相對表達水平[20]。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequnences

1.5 數據處理

數據采用Levene 檢驗法檢測方差齊次性，pH 和PHE 2 個因素共同脅迫采用SPSS 22.0 軟件進行雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，同一因素脅迫采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析 (One-way ANOVA)，最后對實驗結果采用Duncan's 法進行多重比較，采用t檢驗法檢測同一pH 下PHE的毒性。實驗結果以“平均值±標準差 ()”表示，P<0.05 為統計學差異顯著。

2 結果

2.1 中華絨螯蟹肝胰腺和鰓組織結構

中華絨螯蟹肝胰腺由柱狀上皮 (即肝小管) 構成，管腔(Lumen,Lu) 結構呈星型。PHE 脅迫下，pH 7.8 時肝胰腺星型結構稍有改變，且基膜脫落，細胞頂端微絨毛(Microvilli,MV) 部分脫落、微絨毛黏膜 (Enteric coat,EC)完整但R 細胞處出現空泡 (圖1-a)。在pH 6.5 條件下，肝胰腺管腔擴張，但基膜沒有明顯脫落，微絨毛黏膜部分破損、B 細胞部分破損 (圖1-b)。在pH 5.5 下，管腔結構明顯擴張，部分柱狀上皮細胞解體，細胞核固縮破碎，R 細胞出現萎縮、胞質空泡化，微絨毛黏膜破損 (圖1-c)。

圖1 中華絨螯蟹肝胰腺和鰓組織暴露在 PHE (50 μg·L-1) 和 pH (7.8、6.5 和 5.5) 中14 d 后的病理變化注：a.pH 7.8×PHE 50 組肝胰腺；b.pH 6.5×PHE 50 組肝胰腺；c.pH 5.5×PHE 50 組肝胰腺；d.pH 7.8×PHE 50 組鰓；e.pH 6.5×PHE 50 組鰓；f.pH 5.5×PHE 50 組鰓。Fig.1 Pathological changes of hepatopancreas and gill tissues of E.sinensis after exposure to PHE (50 μg·L-1) and pH (7.8,6.5 and 5.5) for 14 dNote: a.Hepatopancreas in pH 7.8×PHE 50 group; b.Hepatopancreas in pH 6.5×PHE 50 group; c.Hepatopancreas in pH 5.4×PHE 50 group;d.Gill in pH 7.8×PHE 50 group; e.Gill in pH 6.5×PHE 50 group; f.Gill in pH 5.5×PHE 50 group.

中華絨螯蟹幼蟹的鰓由數條形狀規整的鰓絲以及一條鰓軸組成。鰓葉分為上皮層和血腔，而上皮層主要由角質層、上皮細胞層以及基膜組成。通過HE 染色法對中華絨螯蟹鰓組織的形態結構變化進行觀察，所有處理組肝胰腺結構均有不同程度的改變 (圖1)。PHE 脅迫下，pH 7.8 時鰓絲厚度變薄，局部基膜出現脫落，部分角質層表皮分離，近鰓腔部分有血細胞存在 (圖1-d)。而在pH 6.5 條件下，鰓軸厚度變厚，但鰓絲的基膜完整，角質層表皮平整(圖1-e) 。在pH 5.5 下，鰓絲形狀扭曲，部分角質層表皮破損，基膜脫落，鰓軸出現空泡化 (圖1-f)。

2.2 中華絨螯蟹肝胰腺能量代謝指標

如圖2-a 所示，在PHE 0 μg·L-1組中，中華絨螯蟹TG 濃度隨著pH 降低而顯著降低 (P<0.05)。而在PHE 50 μg·L-1組中，pH 6.5 處理時，TG 濃度最高，且顯著高于單獨pH 6.5 處理 (P<0.05)；pH 5.5 時，TG 濃度最低，且低于pH 7.8 條件下的TG 濃度。pH 和PHE 的交互作用對中華絨螯蟹TG 濃度有顯著影響 (P<0.05，表2)。

圖2 不同 pH 條件下 PHE 濃度對中華絨螯蟹能量代謝指標的影響注：數值表示為“平均值±標準誤”(n=3)；方柱上方不同大寫字母表示在PHE 0 μg·L-1 下差異顯著 (P<0.05)；不同小寫字母表示在PHE 50 μg·L-1 下差異顯著 (P<0.05)；*表示相同pH 下組間差異顯著 (P<0.05)。圖3 同此。Fig.2 Effect of PHE concentration on energy metabolism indexes of E.sinensis under different acidification conditionsNote: Values are represented as Mean±SE (n=3); different uppercase letters above the columns represent significant differences at PHE 0 μg·L-1(P<0.05); different lowercase letters represent significant differences at PHE 50 μg·L-1 (P<0.05); * represents significant differences between the two groups at the same pH values (P<0.05).The same case in Fig.3.

表2 pH 和 PHE 對中華絨螯蟹肝胰腺甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和糖原含量影響的雙因素方差分析Table 2 Two-way analysis of variance for influence of pH and PHE on contents of TG,HDL-C,LDL-C and Gly in E.sinensis hepatopancreas

與對照組 (pH 7.8×PHE 0) 相比，PHE 使得Gly 濃度顯著降低 (P<0.05)，在PHE 0 μg·L-1組中，Gly 濃度也隨著pH 的降低而顯著下降 (P<0.05，圖2-b)。pH 和PHE 的交互作用對中華絨螯蟹Gly 濃度變化有顯著影響 (P<0.05，表2)。在PHE 50 μg·L-1組中，Gly 濃度隨著pH 降低而顯著下降(P<0.05)，在pH 5.5 時達到最低，為所有實驗組中的最低值 (P<0.05，圖2-b)。

HDL-C 也有相似的結果，無論是否存在PHE，pH 的降低均可導致中華絨螯蟹HDL-C 濃度顯著降低 (P<0.05，圖2-c)，且pH 和PHE 的交互作用也對中華絨螯蟹HDLC 濃度有顯著影響 (P<0.05，表2) 。

pH 和PHE 的交互作用對中華絨螯蟹的L D L-C濃度也有顯著影響 (P<0.05，表2)。在PHE 0 μg·L-1組中，與pH 7.8 相比，pH 6.5 及pH 5.5 條件下LDL-C濃度均出現了顯著降低 (P<0.05)，且pH 5.5 組顯著低于pH 6.5 組 (P<0.05)。在PHE 50 μg·L-1組中，pH 6.5 及pH 5.5 條件下LDL-C 濃度也出現顯著下降 (P<0.05)，但兩組間無顯著性差異 (P>0.05，圖2-d)。

2.3 中華絨螯蟹肝胰腺中ahr、arnt、cyp1a1 基因表達水平

實時熒光定量PCR 檢測了pH 和PHE 對中華絨螯蟹肝胰腺中的ahr、arnt、cyp1a1基因相對表達量的影響(圖3)。在PHE 0 μg·L-1組中，與pH 7.8 組相比，pH 6.5 組ahr基因表達量顯著降低 (P<0.05)，而pH 5.5 組的ahr基因表達量則顯著升高 (P<0.05)。在PHE 50 μg·L-1組中，隨著pH 的降低，ahr基因表達量顯著升高 (P<0.05)，且在pH 6.5 及pH 5.5 條件下，均顯著高于PHE 0 μg·L-1組(P<0.05，圖3-a)。pH 5.5×PHE 50 組的ahr基因表達量為所有組中最高。pH 與PHE 的交互作用對ahr基因的表達量具有顯著影響 (P<0.05，表3)。

圖3 不同 pH 條件下 PHE 濃度對中華絨螯蟹肝胰腺基因表達量的影響Fig.3 Effect of different PHE concentrations on expression of hepatopancreas genes in E.sinensis under acidification conditions

表3 pH 和 PHE 對中華絨螯蟹 ahr、arnt、cyp1a1 基因表達量影響的雙因素方差分析Table 3 Two-way analysis of variance for effects of pH and PHE on ahr,arnt and cyp1a1 gene expression of E.sinensis

PHE 0 μg·L-1組中，與對照組相比，pH 5.5 和pH 6.5 處理均未使arnt基因表達量出現顯著性變化 (P>0.05，圖3-b) 。而在PHE 50 μg·L-1組中，隨著pH 的降低，arnt基因的表達量隨之顯著升高 (P<0.05)，且在pH 5.5 和pH 6.5 下，均顯著高于PHE 0 μg·L-1組 (P<0.05，圖3-b)。同樣，pH 與PHE 的交互作用對arnt基因的表達量也有顯著性影響 (P<0.05，表3)。pH 5.5×PHE 50 組的arnt基因表達量也為所有組中的最大值。

對于cyp1a1基因而言，在PHE 0 μg·L-1組中，與pH 7.8 組相比，pH 6.5 使cyp1a1基因的表達量顯著降低(P<0.05) ，而pH 5.5 處理使cyp1a1基因的表達量顯著升高(P<0.05，圖3-c)。在PHE 50 μg·L-1組中，pH 的降低使得cyp1a1基因的表達量顯著升高 (P<0.05，圖3-c)，在pH 5.5 條件下，cyp1a1的基因表達量最高。pH 和PHE 對cyp1a1基因的表達量有顯著的交互作用 (P<0.05，表3)。

3 討論

鰓是甲殼動物重要的呼吸器官，也是重要的滲透壓和離子調節器官[21]，肝胰腺是中華絨螯蟹的主要消化腺，因而環境污染物很可能對中華絨螯蟹的鰓和肝胰腺造成組織損傷。本研究中，PHE 對中華絨螯蟹的鰓和肝胰腺均造成了一定程度的損傷，這與一些污染物造成中華絨螯蟹組織損傷的研究相一致[15]。肝胰腺作為甲殼類動物的重要多功能器官，不僅參與食物消化吸收相關的消化酶的合成和分泌，且在能量代謝中具有重要作用[22]。中華絨螯蟹肝胰腺小管的R 細胞以及B 細胞頂端的微絨毛和微絨毛表面的黏膜對物質轉運具有重要作用[14]。本研究中，不同pH 與PHE 聯合作用均對其造成不同程度的損傷，說明PHE 對中華絨螯蟹呼吸和消化系統產生了影響，從而影響其能量代謝。同時R 細胞是重要的脂肪和糖原貯藏場所，且能量的消耗往往會導致細胞收縮和萎縮[23]。本研究中，在pH 7.8 及5.5 下，PHE 不僅使得肝小管細胞頂端的微絨毛和微絨毛表面的黏膜脫落破損，而且使得肝小管R 細胞萎縮、空泡化，說明在pH 7.8 及5.5 下，PHE 對中華絨螯蟹的糖代謝和脂代謝均產生了一定影響。因而相較于正常的pH，pH 6.5 在一定程度上緩解了PHE 對中華絨螯蟹的組織損傷，而pH 5.5 則加劇了PHE 對中華絨螯蟹肝胰腺的組織損傷，這也表明在極端環境下，生物體可能通過大量的能量消耗以抵御外界壓力[24]。

此外，肝胰腺還被認為是多種環境應激的關鍵靶器官[17]。研究表明，當受到環境壓力時，甲殼類動物需要額外的能量來維持體內平衡[25]。pH 作為水生動物生長發育重要的環境因子[26]，其異常變化往往導致動物機體代謝失調，能量消耗增加[27]。TG、Gly、HDL-C、LDL-C 等物質的動態平衡對機體健康至關重要，它們在機體的免疫反應和抗氧化能力中發揮著重要作用[28-29]。本研究中，在pH 7.8 條件下，PHE 導致Gly 濃度顯著降低，說明糖類是中華絨螯蟹遭受環境壓力時優先利用的物質之一，這與對一些魚類的研究相一致[30]。與中華絨螯蟹暴露于苯并芘 (Bap)中的研究結果也類似[31]，說明PAHs 會引起中華絨螯蟹的能量消耗。而不同的pH 與PHE 的聯合作用均使中華絨螯蟹肝胰腺Gly 顯著降低，尤其在pH 5.5 條件下，PHE 對Gly 的影響最為顯著，說明機體抵御環境壓力時會產生能量損耗[24]。

對于TG 而言，單獨的PHE 處理并未使中華絨螯蟹肝胰腺TG 發生顯著改變，甚至在pH 6.5 下，PHE 誘導TG 濃度較單獨PHE 處理組顯著升高，這可能是中度的酸化誘導了中華絨螯蟹對外界環境的積極響應，某種程度上減輕了PHE 的毒性，降低了脂質的消耗[32]。但pH 5.5 與PHE 聯合脅迫時，TG 濃度為所有組中最低，表明重度酸化加劇了PHE 對中華絨螯蟹糖代謝和脂代謝的影響。而HDL-C 和LDL-C 在膽固醇向組織運輸的過程中起著重要作用[33-34]，其在其他動物上的研究往往與“疾病”因素呈現負向關系[35]。本研究中，單獨PHE 處理使得中華絨螯蟹肝胰腺HDL-C 濃度較對照組顯著降低，表明低濃度的PHE 對中華絨螯蟹存在潛在風險。而不同程度pH 與PHE 的聯合作用均對中華絨螯蟹HDL-C 產生了顯著影響，尤其是pH 5.5×PHE 50 組，肝胰腺HDL-C 濃度為所有組中最低，表明酸化和PHE 協同處理對中華絨螯蟹能量代謝具有顯著影響。與之相似，酸化和PHE 的聯合作用也會使得LDL-C濃度顯著降低。

pH 和PHE 的聯合作用導致TG、Gly、HDL-C、LDL-C濃度的顯著變化，尤其在pH 5.5 的重度酸化條件下，PHE 顯著影響了中華絨螯蟹的能量代謝平衡。由此可見，不同環境應激源可能會產生協同效應，從而影響甲殼動物的能量代謝過程，這與銅 (Cu) 和土霉素 (Oxytetracycline)協同效應誘導了草魚 (Ctenopharyngodonidella) 的脂質代謝的研究結果相一致[36]。

本研究中，PHE 顯著促進了arnt和cyp1a1基因的表達，且酸化條件顯著提高了ahr和arnt基因的表達，并最終導致cyp1a1基因表達量的顯著升高。Holen 和Olsvik[37]同樣發現PHE 對大西洋鱈 (Gadusmorhua)cyp1a1基因表達的誘導，同時還發現脂多糖 (Lipopolysaccharide) 和PHE 的交互作用對cyp1a1基因的顯著誘導。Guo 等[38]報道了PAHs可以誘導菲律賓蛤仔 (Ruditapesphilippinarum) 中ahr基因的表達；Liu 等[39]發現苯并芘 (BaP) 可顯著誘導櫛孔扇貝(Chlamysfarreri) 中ahr基因的表達；低濃度BaP 可誘導櫛孔扇貝中ahr和arnt基因的表達[40]；Lima 等[41]在牡蠣(Crassostreagasar) 中也發現pH 和PHE 協同效應對cyp家族基因的誘導。這與本研究結果一致，本實驗也發現pH與PHE 協同作用可誘導中華絨螯蟹cyp1a1基因的表達。

ahr基因與脂類代謝以及能量代謝有重要關聯，有研究指出ahr對哺乳動物脂質代謝具有調控作用[42]，多氯聯苯或ahr配體暴露導致魚類肝糖原濃度降低的研究也有相關報道[43]。本研究也闡明了PHE 對中華絨螯蟹脂質代謝產生影響的重要原因，而過度的酸化與PHE 產生交互效應，顯著影響了中華絨螯蟹的能量代謝。相關研究指出，在無脊椎動物中，PAHs 的解毒代謝經由I 相的AHR-ARNT 信號通路以及II 相的谷胱甘肽-S-轉移酶 (GST) 代謝進行，期間產生大量的活性中間體和活性氧 (Reactive oxygen species,ROS)，干擾水生生物的正常生理功能[44]。因此，pH 和PHE 協同作用可能對中華絨螯蟹能量代謝及抗氧化系統產生影響。

本研究結果表明，從組織結構方面，pH 6.5 可以緩解PHE 的毒性作用；從能量代謝、基因表達方面，隨著pH 的降低，PHE 毒性的影響也隨之增強。