基于耳石地標點法的南黃海和東海小黃魚種群關系研究

梁 龍，宋大德，康中杰，張琥順，李國東，吳曉睿，李冬佳，王淑艷，閆 欣，祝 斐，熊 瑛

1.上海海洋大學 海洋科學學院，上海 201306

2.江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007

3.華東師范大學河口海岸國家重點實驗室，上海 200241

小黃魚 (Larimichthyspolyactis) 屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬，廣泛分布于我國東海、黃海和渤海海域[1]。小黃魚曾為我國“四大海產”之一，近十年其全球年產量穩定保持在30 萬噸以上[2]，是中國、朝鮮和韓國近海海域的重要經濟魚類之一[1,3]。小黃魚是典型的海洋洄游型魚類[4]，以南黃海為例：每年3—5 月，小黃魚遷徙至蘇北近海(水深10～20 m) 海域產卵；6—9 月，向外洄游至機輪拖網禁漁區線附近 (水深30 m 左右) 海域索餌；10—11 月，開始逐步游向外海越冬；12 月至翌年2 月在濟州島西南、東海中南部海域越冬[5-6]，棲息海域溫度是驅使其洄游的重要因素[7-8]。正因小黃魚多樣的生境履歷且不同種群的洄游路線不盡相同[9]，其總體上呈現出復雜的族群結構，不同的地理族群之間具有相對獨立的種群動態，但彼此之間也存在個體的遷入與遷出[10]。迄今，針對小黃魚地理族群劃分特別是黃海南部海域的小黃魚群體劃分尚未有統一的定論。林新濯等[11]通過對比不同海域小黃魚的生物學特征指標，認為中國近海海域的小黃魚可以分為3 個地理種群，分別是黃-渤海、南黃海和東海群；在21 世紀初之前，這一結論廣受學界認可[12-13]，但之后，徐兆禮和陳佳杰[9]剖析了1971—1982 年我國十幾家漁業公司的漁撈日志，發現南黃海和東海的小黃魚在地理分布上未表現出明顯的地理隔離現象，認為中國近海海域小黃魚可劃分為兩個群體，即渤海-北黃海群和東海-南黃海群，后期研究也支撐了這一結果[10,14]；Zhang等[15]、Xiao 等[16]和Zheng 等[17]利用基因組學探究黃海和東海北部小黃魚的種群結構，發現地理族群間的基因差異不顯著，且存在高度的基因流現象。造成以上觀點分歧的主要原因是所用方法不同，因此，采用當前的魚類群體劃分方法厘清小黃魚的地理族群，對其資源科學管理及種群恢復具有重要意義。

耳石存在于硬骨魚類內耳中，是由鈣經生物礦化形成的一種碳酸鈣結晶，隨魚類個體生長每日沉積且不易代謝[18]。耳石內側面具有明顯的“聽溝(Sulcus acusticus)”凹槽，起到控制魚體平衡和聽覺的功能[19]。耳石及其“聽溝”的形態具有種間差異，常被用于區分種間的近似種[20-21]和種內的不同地理族群[22-23]。宋大德等[6]利用耳石微化學中的耳石、鍶 (Sr)/鈣 (Ca) 探究了南黃海小黃魚早期發育階段的連通性，對連云港、鹽城和南黃海外海的小黃魚產卵群體進行了有效劃分。耳石形態學作為劃分魚類群體的方法，得到了廣泛應用。目前，框架分析法 (Framework analysis method) 和幾何形態測量法 (Geometric morphometrics) 是耳石形態分析領域兩種主要的研究方法?？蚣芊治龇ㄖ饕峭ㄟ^度量耳石形狀參數 (長、寬、最長半徑、最短半徑和厚度等) 并結合耳石質量和面積，從而獲得一些形態指標[24]，但該方法不能有效提取耳石的一些關鍵形態指標信息，因此對種間區分不同地理族群的效果甚微[25-26]。幾何形態測量法主要包括基于耳石輪廓的傅里葉分析法 (輪廓法) 和基于笛卡爾地標的地標點法。其中，傅里葉分析法是對耳石二維投影后通過橢圓傅里葉分析提取表征耳石輪廓信息的傅里葉系數，然后通過判別分析和主成分分析等方法區分魚類種類或種群[24]，該方法受限于耳石完整度和輪廓規則度，在耳石輪廓較不規則或有所缺損的情況下，會表現出一定的不適宜性[27]；地標點法是通過分析耳石輪廓和聽溝等重要區域的形態信息，將形態差異與變化定量描述和可視化，且利用多變量技術來研究多維關系的一種方法，在魚類種類和種群區分中已得到廣泛應用[24-26]。關于小黃魚個體和耳石形態的已有研究主要采用框架分析法[28-29]和傅里葉分析法[29]，尚未見有采用地標點法的研究報道。

本研究基于2022 年采自海州灣、呂泗、長江口和舟山漁場的1 齡小黃魚樣品，利用地標點法分析其矢耳石樣本的形態特征，探究了南黃海和東海海域小黃魚不同地理族群之間的連通性，以期完善小黃魚的空間分布格局，為其管理單元的合理規劃提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

為減少魚體體長和年齡效應引起的耳石形態變化的干擾，避免因小黃魚種群洄游而造成不同海域樣本交叉帶來的誤差，本研究選取1 齡魚為研究對象?？抵薪艿萚30]比較了國內近30 年小黃魚的von Bertalanffy 生長方程退算 (Back-calculate) 魚體年齡的精度，發現生長方程Lt=366[1-e-0.11777(t+1.76429)][31]的退算年齡效果最佳，退算出1 齡魚個體的體長范圍為100～120 mm。為確保采集的樣品歷經的洄游周期一致，2022 年分別在海州灣、呂泗、長江口和舟山漁場 (圖1)，通過捕撈漁獲篩選采集了30 尾體長符合以上退算范圍的1 齡小黃魚樣品。將冷凍保存的樣品運送至陸基實驗室，參照GB/T 12763.6—2007《海洋調查規范》中的生物學測定方法對所選樣品進行體長 (精確到0.01 mm)、體質量 (精確到0.01 g) 等測定 (表1)。對4 個海域小黃魚體長進行單因素方差分析 (One-way ANOVA)。

表1 4 個漁場小黃魚樣本詳細信息Table 1 Detailed information of L.polyactis sampled from four fishing grounds

圖1 小黃魚采樣站點及其洄游路線注：洄游路線圖參考文獻[32]。Fig.1 Map of sampling sites and migratory routine of L.polyactisNote: Migration route map sees Reference [32].

1.2 耳石處理

小黃魚生物學測定完成后，解剖魚體并用鑷子摘取其矢耳石，然后去除表面有機質，乙醇清洗，烘箱干燥，最后編號保存于離心管待拍照。本研究統一選取小黃魚左矢耳石為研究對象，首先將耳石具聽溝的一側 (內側面)朝上放置并沿耳石最長軸水平固定，然后用體式顯微鏡 [Nikon-SMZ800N，尼康精機 (上海) 有限公司；配套軟件NIS-Elements D 5.20.00 64-bit] 在同一放大倍率下對耳石形態進行拍攝和圖像采集 (圖2)。

圖2 海州灣、呂泗、長江口和舟山漁場的小黃魚左矢耳石內側面11 個地標點位置圖Fig.2 Positions of 11 landmarks on inner profile of left otolith morphology of L.polyactis sampled in Haizhou Bay (HZB),Lyusi (LS),Yangtze Estuary (YTE) and Zhoushan (ZS) fishing grounds

1.3 地標點法分析

本研究地標點軟件的使用參考姜濤等[33]。1) 利用tpsdig 2.12 軟件，建立小黃魚耳石照片上地標點的坐標位置 (圖2)，選取小黃魚耳石形態上的耳石輪廓端點7 個 (1—7) 和內測面“聽溝”輪廓拐點4 個 (8—11)，并生成相應的坐標數據文件；2) 使用tipsmall 1.2 軟件對獲取的數據文件進行最小平方和法則回歸分析，以檢驗所選取地標點的有效性；3) 利用tpsRelw 1.46 軟件進行普式疊加，并對地標點的坐標值進行一系列旋轉和放大，計算平均形和相對扭曲得分；4) 利用tpsRegr 1.36 軟件進行薄板樣條分析，生成小黃魚耳石形態網格圖，并比較分析其平均形態之間的形扭曲和變化差異。

1.4 數據分析

使用Origin 2023 軟件進行數據處理、主成分分析和聚類分析，對樣本的體長、體質量作單因素方差分析，數據以“平均值±標準誤 ()”表示，顯著性水平為P<0.05。

2 結果

2.1 矢耳石形態地標點分析

對矢耳石地標點的數據文件進行最小平方回歸分析，結果顯示，其切空間距離 (Distance in tangent space，y軸) 與普式距離 (Procrustes distance，x軸) 之間的回歸系數是0.99，驗證了所選取地標點的有效性。通過tpsRelw 軟件對4 個漁場120 個樣本的小黃魚矢耳石地標點分析，可以計算出11 個地標點的平均形和4 個漁場小黃魚矢耳石地標點的重疊圖。相對扭曲分析顯示 (表2)，在所選11 個地標點中，小黃魚耳石聽溝“尾端部”和“口端部”與中間“頸狀部”的交點 (地標點8—11) 的相對扭曲貢獻率占比較大 (91.88%)。其中，地標點11 的貢獻率最高 (45.40%)，其次為地標點10 (36.86%)，表明聽溝區域的地標點在4 個漁場小黃魚的矢耳石形態區分中作用最大。

2.2 幾何形態分析

基于相對扭曲的方法對4 個漁場的小黃魚矢耳石形態地標點進行主成分分析后，共提取了18 個主成分 (表3)。其中，前3 個主成分對耳石形態總體變異的貢獻率分別為89.93%、2.21%、1.96%，累計貢獻率為94.10%。從二維主成分析圖 (圖3)可以看出，第1、第2 主成分散點圖中部分海州灣漁場的群體被顯著地隔離為一個單獨類群，剩余部分海州灣漁場群體和其他漁場 (呂泗、長江口和舟山) 的群體高度重疊為一個類群，無法區分。從前3 個主成分的三維分析圖 (圖4) 可以看出，第1、第2 主成分的效果與二維散點圖一致，并且部分海州灣漁場的小黃魚和其余3 個漁場高度重疊的部分從第2、第3 主成分也未得到明顯的區分。

表3 18 個相對扭曲得分的特征值和貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of 18 relative warps scores

圖3 相對扭曲分數第1、第2 主成分散點圖 (主成分得分×102) 和網格變形圖 (變異擴大10 倍)注：HZB.海州灣漁場；LS.呂泗漁場；YTE.長江口漁場；ZS.舟山漁場。圖4 同此。Fig.3 Scatterplots of relative warp scores on 1st and 2nd principal component (Principal component scores are enlarged 102 times)and grid deformation of otolith (Variation are enlarged 10 times)Note: HZB.Haizhou Bay fishing ground; LS.Lyusi fishing ground; YTE.Yangtze Estuary fishing ground;ZS.Zhoushan fishing ground.The same case in Fig.4.

圖4 相對扭曲分數第1、第2、第3 主成分3D 散點圖Fig.4 3D scatterplots of relative warp scores on 1st,2nd and 3rd principal component

利用tpsRegr 軟件對4 個漁場的小黃魚矢耳石形態進行地標點可視化分析，并在此基礎上將結果放大10 倍后，可以清晰地看出每個地標點在網格中的變化趨勢和程度 (圖3)。其中，變化最明顯的為耳石外輪廓上的地標點3、4、6 和耳石聽溝區域的地標點8、9、10，具體表現為海州灣漁場和呂泗漁場耳石外輪廓有向外變化的趨勢，且海州灣漁場更加明顯。耳石聽溝的整體區域有向右變化的趨勢。長江口漁場和舟山漁場耳石形態向內變化，且舟山漁場變化更加明顯。

2.3 聚類分析

基于耳石地標點的相對扭曲得分進行的聚類分析結果顯示，4 個漁場的小黃魚群體聚為兩個類群，即呂泗、長江口和舟山漁場聚為一個類群，海州灣漁場單獨聚為一個類群，其個體的歐式距離為0.9 (圖5)。

圖5 海州灣、呂泗、長江口和舟山漁場小黃矢耳石形態聚類分析結果Fig.5 Dendrogram for hierarchical cluster analysis by otolith morphology of L.polyactis population in Haizhou Bay,Lyusi,Yangtze Estuary and Zhoushan fishing grounds

結合主成分分析的結果，本研究表明海州灣漁場存在2 個小黃魚種群，即海州灣漁場代表的北黃海-渤海群，呂泗、長江口和舟山漁場代表的南黃海-東海群。

3 討論

3.1 耳石形態在種間及種內識別能力分析

魚類種間和種內不同群體的識別是種群生物學研究的基礎，而隨著魚體的生長，其耳石形態趨于穩定。自從耳石形態應用于魚類種群劃分之后，其逐步發展成為魚類種群研究的重要手段之一[24]。同時，魚類形態分析方法也得到長足發展，且對魚類群體的識別能力不斷提升。據Xiong 等[34]報道當小黃魚體長達到130 mm 時，其矢耳石形態趨于穩定，推測耳石形態可能于首次性成熟時發生了顯著變化。Jiang 等[35]研究指出小黃魚第一次性成熟發生在1 齡左右，根據本文所用公式反演退算出1 齡小黃魚體長為100～120 mm，而體長為130 mm 時小黃魚已經達到2 齡。因此，筆者認為小黃魚耳石形態的顯著變化可能發生于2 齡左右，并非在第一次性成熟時。究其原因，可能是以往報道中體長約130 mm 的1 齡小黃魚使用了不同的年齡鑒定方法及生長方程所致。

本文利用地標點法對南黃海和東海小黃魚耳石形態進行分析，結果發現在海州灣漁場存在兩個耳石形態差異明顯的小黃魚群體，即北黃海-渤海群體和南黃海-東海群體，且發現其耳石形態差異主要來源于耳石聽溝區域，對比這兩個小黃魚群體的耳石形態發現，北黃海-渤海群體小黃魚耳石聽溝上的地標點8、9、11 均有向耳石“頸狀部”內部變化的趨勢，說明該群體小黃魚耳石聽溝的“頸狀部”相較于南黃海-東海群體有變短的趨勢。Jiang等[10]通過比較海州灣漁場的小黃魚成魚的耳石形態和魚卵大小發現，在海州灣漁場存在兩個小黃魚種群，且耳石形態總判別率達91.7%。耳石形態不僅在種內具有高識別能力，對魚類種類也具有較好的識別效果。姜濤等[33]采用地標點法分析九龍江口和珠江口的鳳鱭 (Coiliamystus) 與七絲鱭(C.grayii) 的耳石形態差異，結果顯示兩個魚種的總正確判別率高達100.0%。張申增等[36]對紅鰭笛鯛 (Lutjanuserythopterus) 和紫紅笛鯛 (L.argentimaculatus) 的耳石形態進行分析，其物種總判別率達82.8%。不同群體之間顯著的耳石形態差異是取得較高識別效果的基礎，耳石形態差異除了與耳石不同的年輪寬度增量和輪廓因子有關外，還與耳石內側面的聽溝區域形態有較大關系。侯剛等[37]在基于地標點法對北部灣4 種白姑魚矢耳石形態識別中，選取位于聽溝區域的地標點總貢獻率 (95.08%)遠高于外輪廓上地標點總貢獻率(4.12%)，其矢耳石形態差異主要表現在聽溝的“頸部”、“頭部”和“尾部”。本文中所選取聽溝區域地標點8—11 的總體貢獻率 (91.88%) 也遠高于耳石輪廓上地標點1—7 的總體貢獻率 (8.12%)，其矢耳石形態差異主要來源于聽溝兩端“口端部”和“尾端部”與中間“頸狀部”的交點 (地標點8—11)。

耳石形態受到遺傳和環境的共同作用[38]。目前，利用分子生物學手段來區分魚類物種已被廣泛認可和使用，但是對遺傳分化不明顯的同一物種不同地理群體，采用分子生物學手段來劃分群體有一定的局限性[16-17,39]，而對這類群體利用魚類耳石形態學來劃分種群則相對容易且更具優勢[24-26]。地標點法可以有效提取耳石的大部分形態信息，目前魚類種內和種間的識別效果可基本滿足需求。然而，該方法只是分析魚類耳石具有聽溝區域的一個面，限制于二維平面，對耳石整體形態信息無法提取和分析。隨著現代高精度儀器的涌現和3D 技術的逐步成熟，提取魚類耳石整體形態信息已成為可能。Gu 等[40]基于X 射線微計算機斷層掃描技術 (Micro-CT) 和掃描電子顯微鏡 (SEM) 分析了黃唇魚(Bahabataipingensis) 矢耳石，發現其背面具有許多細長的棱柱晶體構成晶體簇，初步揭示了黃唇魚耳石的聲學功能結構。Martí-Puig 等[41]使用三維耳石圖像分析方法，將耳石的整體形態信息以數據集的形式呈現，形態學與三維模型的結合將為魚類形態學研究提供深層次的分析和更有力的依據。

3.2 南黃海和東海的小黃魚種群劃分

本研究基于在耳石外輪廓和聽溝上建立的11 個地標點提取耳石形態特征信息，經分析顯示南黃海和東海海域存在兩個在耳石內側面聽溝區域形態差異顯著的小黃魚種群，即北黃海-渤海群和南黃海-東海群，且在海州灣漁場存在這兩個種群的混棲群體。

每年隨著水溫的上升，小黃魚便逐漸向近岸產卵洄游，產卵高峰期存在著自南向北的緯向滯后差異，例如舟山漁場小黃魚的產卵高峰期一般在3 月，呂泗漁場則在4 月[32]。小黃魚產卵后會向外海洄游至機輪拖網禁漁區線附近索餌，小黃魚魚卵此時完全不具備自主游泳能力，其魚卵—仔魚階段基本是處于“隨波逐流”的狀態[42]，因此，分析當時的海洋動力環境對深入理解小黃魚種群結構具有重要意義。2018 年3—7 月，對長江口鄰近海域的小黃魚魚卵、仔稚魚的調查結果顯示：3 月其魚卵主要分布在機輪拖網禁漁區線內舟山漁場北部水域 (水深10～30 m)，4 月魚卵遍布禁漁區線內長江口漁場，5 月魚卵和仔魚重心偏移至呂泗漁場，從整體看小黃魚魚卵、仔魚的分布重心是逐漸北移的[43]。物理海洋動力機制分析可知：3 月，高溫高鹽的臺灣暖流北上至舟山漁場，為小黃魚產卵創造了良好的環境[44]；4 月，隨著長江口漁場水溫的上升，受臺灣暖流輸送影響，小黃魚魚卵、仔魚遍布在禁漁區線內的長江口漁場[45]；5 月，在強勁的東海潮汐和盛行的東亞季風共同作用下，一部分長江沖淡水會持續北上至蘇北淺灘鄰近海域，此時禁漁區線內的長江口漁場和呂泗漁場便成了南黃海-東海小黃魚種群的主要育幼場[46]。綜上可知，南黃海-東海小黃魚種群魚卵、仔魚階段主要受臺灣暖流和長江沖淡水等流系控制，并不存在長江沖淡水會在此形成一道隔離東海和南黃海小黃魚群體的屏障。

每年的4 和5 月分別是呂泗漁場和海州灣漁場小黃魚的產卵高峰期[34]，此時，在北向的潮致余流輸運下[47-48]，呂泗漁場會有部分小黃魚魚卵、仔魚被輸送至海州灣鄰近水域，在海州灣漁場形成兩地的小黃魚混棲群體。黃康康等[49]通過水動力物理模型模擬呂泗漁場小黃魚魚卵輸運路徑發現，在呂泗漁場不同年份釋放的粒子，其輸運走向基本偏北朝向海州灣漁場；Zhang 等[50]通過比較海州灣漁場小黃魚耳石年輪寬度變量和耳石輪廓等因子發現，在海州灣漁場存在兩個來自不同越冬場的小黃魚群體。由此可知，北黃海-渤海種群和南黃海-東海種群之間并未形成真正的地理隔離，且存在較高的個體交流現象，說明海州灣漁場是小黃魚不同群體之間個體交流的主要海域之一。這與眾多探究小黃魚種群基因結構的發現一致，即各小黃魚地理群體間不存在顯著的基因差異[16-17,38]。除了兩個種群棲息水域環境造成的影響外，筆者認為，兩個種群攝食特征差異也可能是導致其耳石形態存在顯著性差異的原因。例如：在長江口漁場，小黃魚主要以甲殼類和魚類為食，優勢種包括糠蝦、磷蝦、七星底燈魚 (Benthosemptterotum)、脊腹褐蝦 (Crangon affinis) 和鷹爪糙對蝦 (Trachysalambriacurvirostris)等；而在海州灣漁場，小黃魚主要以太平洋磷蝦(Euphausiapacifica)、脊腹褐蝦 (C.affinis)、細螯蝦(Leptochelagracilis) 和赤鼻棱鳀 (Thryssakammalensis) 等為食[51]。