CDK4基因在骨肉瘤細胞中的表達及功能研究

李健雄，韓雨辰，杜祎萌，薛春源，鄭亞男，亢小峰，房廖鑫，許 猛，徐小潔，畢文志

1 解放軍醫學院，北京 100853；2 解放軍總醫院第四醫學中心骨科醫學部，北京 100048；3 軍事科學院軍事醫學研究院生物工程研究所，北京 100850；4 解放軍總醫院京南醫療區，北京 100850

骨肉瘤是一種好發于兒童和青少年骨骼肌肉系統的高度惡性腫瘤，年發病率(2 ~ 4)/1 000 000，致殘率和致死率均較高[1-3]。目前初診無轉移的骨肉瘤患者5年總體生存率為65% ~ 75%，由于骨肉瘤異質性較高，對傳統化療藥物的反應性不同，有20% ~ 30%的骨肉瘤患者最終會出現復發或轉移，因此研究免疫治療或分子靶向治療等新治療方案尤為重要[1-2,4-9]。細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，基因定位于人類染色體12q13，是一種能夠調控細胞周期的關鍵激酶，在G1 ~S期中發揮作用[10]。CDK4可以與細胞周期蛋白D(CyclinD)結合，形成復合物CyclinD-CDK4，促使視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，Rb)磷酸化，阻止其與轉錄因子E2F結合，最終結果是E2F不能充分發揮生長抑制功能，促使細胞周期從G1期轉換到S期[11-14]。CDK4促進細胞增殖的作用使其可作為抗癌治療的靶標[15]。本研究利用GEO數據庫中檢索得到的基因表達譜數據集，分析CDK4基因在人骨肉瘤MG63細胞系與正常成骨HOB細胞系中的表達水平差異。通過構建CDK4真核表達載體，探索其對骨肉瘤細胞增殖和遷移的影響，為進一步研究CDK4在骨肉瘤中的作用奠定基礎。

材料與方法

1 材料 人骨肉瘤細胞系(MG63細胞)、pEGFPC1載體和人乳腺文庫由軍事醫學研究院生物工程研究所細胞工程研究室保存提供；CDK4相關引物(北京博邁德公司)；金牌MIX(擎科生物公司)；限制性內切酶(EcoRⅠ和BamHⅠ)、T4 DNA連接酶等試劑(TaKaRa公司)；質粒提取試劑盒和PCR膠回收試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；轉染試劑VigoFect(威格拉斯生物技術有限公司)；高糖DMEM細胞培養基(Thermo Fisher Scientific公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)。

2 數據集的獲取和分析 選擇GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)進行生信分析，在數據庫中搜索與骨肉瘤相關的基因表達譜芯片數據。以“osteosarcoma”為關鍵檢索詞，限制種屬為“homo sapiens”，檢索骨肉瘤相關基因表達譜，下載基因表達譜芯片數據集GSE45275，在其中利用R語言分析工具GE02R，以校正后P＜0.05為閾值，對比數據集內所包含的兩組樣品，找出兩組之間差異表達的基因。

3 構建pEGFP-CDK4重組質粒并測序 在美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站找到CDK4的基因序列，按照其CDS區序列設計上游引物：5'-CGGAATTCTATGGCTACCTCTCGATATGAG-3'；下游引物：5'-CGGGATCCTCACTCCGGATT ACCTTCATC-3'。通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增CDK4基因。此擴增實驗使用人乳腺文庫作為模板。將所得產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶是否與預期位置相符?；厥债a物后用EcoRⅠ和BamHⅠ將其與pEGFPC1空載體進行酶切，用T4連接酶將所得產物進行4 h以上(16℃)的酶連，再將所得產物加入大腸埃希菌感受態細菌DH5α中轉化涂板，使用無菌移液槍頭移取單克隆菌群，擴增此單克隆菌群。使用菌液PCR實驗鑒定所擴增的菌群。將鑒定陽性的克隆繼續進行擴增，從中提取質粒并鑒定。

4 蛋白質免疫印跡實驗測定CDK4蛋白的表達在6 cm皿中接種骨肉瘤MG63細胞，當密度達到70%左右時，將pEGFP-CDK4與pEGFP-C1質粒分別進行轉染。Vigofect (4 μL)轉染試劑與0.9%氯化鈉注射液(200 μL)加至EP管中混勻，靜置5 min，將10 μg的兩種質粒分別混勻在0.9%氯化鈉注射液中，并補齊至200 μL，而后分別加入靜置后的轉染試劑溶液并混勻，靜置15 min后加入皿中。孵育6 h后更換培養基，孵育24 h后消化細胞收于EP管中，3 000 r/min離心5 min棄掉上清液，加入約沉淀體積3倍量的RIPA裂解液并混勻，置于冰上裂解30 min，加入與RIPA裂解液等體積的2 × SDS溶液并混勻，開始SDS-PAGE電泳。電泳完成后進行轉膜。使用5%脫脂奶粉封閉1 h。使用GFP-αm抗體孵育，使用1 × TBST洗膜3次。加入二抗(鼠抗)繼續孵育，使用TBST洗膜后顯影。

5 免疫熒光實驗檢測CDK4蛋白在細胞中的定位骨肉瘤MG63細胞接種于6 cm皿中，培養至密度約70%，將pEGFP-CDK4與pEGFP-C1質粒分別轉染其中，4 ~ 6 h后更換培養基，常規培養24 h。用胰酶消化細胞，并將其鋪于12孔板中，調整細胞密度為30%，貼壁后用1 mL PBS洗滌1次，用4%多聚甲醛于常溫下固定30 min，用PBS洗后，將10 μL Triton X-100 + 20 μL NGS溶液混于2 mL PBS溶液中，加入細胞培養皿中，將細胞培養皿置于冰上，將細胞透化10 min。用DAPI染料將細胞核染色，最后用熒光顯微鏡觀察蛋白的表達。

6 CCK-8實驗測定CDK4蛋白對細胞增殖的作用 轉染pEGFP-CDK4與pEGFP-C1質粒于骨肉瘤MG63細胞中，4 ~ 6 h后更換培養基，常規培養24 h后接種于96孔板，細胞密度3 000/孔，每組樣品設3復孔，待細胞貼壁后，于每孔加入DMEM∶CCK-8(9∶1) 100 μL混合液，放于細胞培養箱中孵育1 h，取上清液，檢測樣品OD450值。轉染后的4 d，每天都在同一個時間點對細胞進行檢測，記錄檢測數值。

7 克隆形成實驗檢測CDK4蛋白對細胞增殖的作用 將已表達CDK4蛋白的MG63細胞和轉染pEGFP-C1質粒的MG63細胞以2 000/孔的細胞密度接種于6孔板中。每組樣品重復設置3個平行孔。細胞培養14 d后，用4%多聚甲醛溶液固定細胞，結晶紫染色，觀察染色后細胞克隆的大小及數目。

8 劃痕實驗檢測CDK4蛋白對細胞遷移的作用將穩定轉染pEGFP-CDK4與pEGFP-C1質粒的骨肉瘤MG63細胞接種于6孔板中，當細胞密度增至90%左右時，用200 μL無菌槍頭垂直于孔板快速劃出一條直線，PBS洗滌去除懸浮細胞后，用不含胎牛血清的培養基繼續培養，于劃線后0 h和24 h在固定的點拍照觀察細胞遷移情況，并用Image J軟件進行測量。

9 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。pEGFP-CDK4對骨肉瘤MG63細胞增殖能力的影響采用雙因素方差分析并用Bonferroni法進行多重比較，采用獨立樣本t檢驗比較兩組其他數據。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CDK4基因在骨肉瘤細胞中表達水平高于正常成骨細胞 基因表達譜芯片數據集 GSE45275由Hospital for Sick Children采用GPL16814芯片平臺完成，采用的數據樣本為骨肉瘤MG63細胞系及成骨細胞HOB細胞系(各7個重復)。使用GE02R工具進行差異基因的篩選，以Padj<0.05為條件，從GSE45275芯片中篩選出共17個差異基因。其中在骨肉瘤中顯著上調表達的有15個(CDC5L、MYC、CDK4、RB1、FOS、SPARC、WWOX、PTEN、MT-ATP6、CDKN1C、HMBS、MT-CO1、RECQL4、MDM2、BCL2L1)，下調表達的有2個(CDKN1A、RUNX2_P1)，見圖1。其中CDK4在骨肉瘤MG63細胞系樣本中表達平均值(1480.1)顯著高于在正常成骨細胞HOB細胞系的表達平均值(342.9)，見圖2。

圖1 MG63細胞和HOB細胞間的基因差異表達情況Fig.1 The differentially expressed genes between osteosarcoma cell line MG63 and osteoblast cell line HOB

圖2 CDK4基因在HOB細胞與MG63細胞間表達水平的對比(bP＜0.01，vs HOB)Fig.2 Comparison of CDK4 gene expression between HOB and MG63 cell line (bP＜0.01, vs HOB)

2 pEGFP-CDK4重組質粒的構建與鑒定 用PCR技術對CDK4進行擴增，電泳后，于約912 bp的位置出現明亮條帶(圖3)。經過回收PCR產物、酶切、酶連、菌液PCR(圖4)、雙酶切，產物進行電泳后可以顯示兩個條帶，分別在約5 000 bp和約912 bp處(圖5)，與載體和目的基因的大小位置相吻合。所提取的質粒檢測其堿基序列，結果顯示其堿基序列為正確序列，因此可以得出重組質粒構建成功的結論。

圖3 PCR擴增人CDK4基因Fig.3 PCR amplification of CDK4 gene

圖4 對重組質粒pEGFP-CDK4進行菌液PCR后鑒定結果Fig.4 PCR identification of recombinant plasmid pEGFP-CDK4 in bacterial liquid

圖5 對重組質粒pEGFP-CDK4進行雙酶切電泳的結果圖Fig.5 The result of double enzyme digestion for recombinant plasmid pEGFP-CDK4 by gel electrophoresis

3 Western blot檢測pEGFP-CDK4蛋白表達 于MG63細胞中轉染pEGFP-CDK4和pEGFP-C1質粒，24 h后裂解收集蛋白，用蛋白質免疫印跡檢測CDK4蛋白表達情況。結果顯示，轉染pEGFPC1質粒的樣品表達的條帶出現在相對分子質量約27 × 103kU處；轉染pEGFP-CDK4質粒的樣品表達的條帶出現在相對分子質量約61 × 103kU處，說明構建出的質?？杀磉_pEGFP-CDK4蛋白(圖6)。

圖6 蛋白質免疫印跡驗證pEGFP-CDK4的蛋白表達Fig.6 The identification of pEGFP-CDK4 using western blot analysis

4 CDK4定位于MG63細胞的細胞核 轉染pEGFP-CDK4重組質粒進入MG63細胞中，待表達后，用熒光顯微鏡觀察pEGFP-CDK4在細胞內的熒光定位。結果顯示，在熒光顯微鏡下pEGFPCDK4分子表達的綠色熒光與DAPI染色細胞核的藍色熒光呈現顯著的重合，并且在細胞質中無明顯可見的綠色熒光。綜上所述，CDK4定位于MG63細胞的細胞核中(圖7)。

圖7 CDK4蛋白在MG63細胞內定位的熒光顯微鏡圖片(400×)Fig.7 Fluorescence images of CDK4 in MG63 cells (400×)

5 CDK4基因促進骨肉瘤細胞增殖 在96孔板中接種轉染pEGFP-CDK4質粒的骨肉瘤MG63細胞，并以轉染pEGFP-C1質粒的MG63細胞作為對照組。每天檢測兩組細胞的OD450值并計算存活率，根據4 d內的細胞存活率數值繪制細胞生長曲線。生長曲線顯示，從第2天開始，轉染pEGFPCDK4質粒的MG63細胞的OD450值顯著高于轉染pEGFP-C1質粒細胞的OD450值。CCK-8實驗證明，CDK4基因可促進骨肉瘤細胞的增殖(圖8)。

圖8 轉染pEGFP-CDK4及pEGFP-C1質粒后細胞0 ~ 4 d的生長曲線(bP＜0.01，vs pEGFP-C1)Fig.8 CCK-8 results of cells transfected with pEGFP-CDK4 and pEGFP-C1 plasmids within four days (bP＜0.01, vs pEGFP-C1)

6 CDK4基因增強骨肉瘤細胞的克隆形成 將pEGFP-CDK4和pEGFP-C1質粒轉染于MG63細胞中，轉染完成后對細胞進行計數，以3 000/孔的細胞密度接種于35 mm的培養皿中，2周后觀察克隆形成的數目。結果顯示，轉染pEGFP-CDK4的細胞形成的平均克隆數顯著高于轉染pEGFPC1的細胞形成的平均克隆數(圖9)。

圖9 轉染pEGFP-CDK4及pEGFP-C1質粒后細胞平板克隆形成情況(bP＜0.01，vs pEGFP-C1)Fig.9 Colony formation assay of cells transfected with pEGFPCDK4 and pEGFP-C1 plasmids (bP＜0.01, vs pEGFP-C1)

7 CDK4基因增強骨肉瘤細胞的遷移能力 將pEGFP-CDK4和pEGFP-C1質粒轉染于MG63細胞中，劃痕后觀察24 h后細胞的遷移情況。結果顯示，轉染pEGFP-CDK4后骨肉瘤MG63細胞的遷移能力顯著增強(圖10)。

圖10 轉染pEGFP-CDK4及pEGFP-C1質粒后細胞遷移能力變化(bP＜0.01，vs pEGFP-C1)Fig.10 Cell migration ability of cells transfected with pEGFPCDK4 and pEGFP-C1 plasmids by scratch assay (bP＜0.01,vs pEGFP-C1)

討 論

CyclinD-CDK4-Rb信號通路是最重要的細胞周期調節通路之一，在細胞增殖過程中發揮了重要作用[14,16-17]。CDK4作為細胞分裂的正向調節因子，已被確定為乳腺癌、脂肪肉瘤、黑色素瘤和膠質母細胞瘤等的潛在治療靶標，由此研發出的CDK4抑制劑或特異性小干擾RNA已成為治療多種惡性腫瘤的候選藥物[11,15,17-19]。有研究報道證實，CDK4在骨肉瘤組織樣本和細胞系中高表達，主要表達在細胞核中，并且已經在骨肉瘤細胞系U2OS和KHOS中進行了驗證[18]。在前期研究的基礎上，我們利用GEO數據庫中與骨肉瘤相關的基因表達譜芯片數據，對比數據集內兩組樣品骨肉瘤MG63細胞系及正常成骨細胞HOB細胞系的差異基因表達情況，發現CDK4在MG63細胞系中的表達水平顯著高于HOB細胞系。我們通過熒光顯微鏡觀察到，CDK4定位于MG63細胞的細胞核中，進一步證實和擴展了前期研究成果，提示我們CDK4可能在骨肉瘤的進展中發揮著關鍵作用。于是我們通過構建穩定轉染pEGFP-CDK4和pEGFP-C1質粒的骨肉瘤MG63細胞證實，CDK4過表達可能促進骨肉瘤MG63細胞的增殖和遷移。骨肉瘤患者死亡的主要原因是腫瘤的遠處轉移和局部復發，增殖和遷移是骨肉瘤細胞惡性生物學行為的重要基礎，鑒于CDK4對骨肉瘤細胞增殖和遷移的重要作用，CDK4可作為骨肉瘤治療的潛在新靶點。

目前，CDK4抑制劑聯合內分泌治療已經廣泛應用于乳腺癌的抗腫瘤治療[12,20]。美國食品與藥品監督管理局已經批準的CDK4抑制劑包括Palbociclib、Ribociclib和Abemaciclib等，均可以用于雌激素受體陽性/人表皮生長因子受體2陰性的進展期乳腺癌患者的治療[17,19,21-23]。一些研究表明，CDK4抑制劑聯合雌激素受體拮抗劑可以顯著延長此類乳腺癌患者的無進展生存期[24-27]。此外，Palbociclib等CDK4抑制劑也被應用于脂肪肉瘤等肉瘤的臨床治療中。二期臨床試驗結果表明，Palbociclib在低不良反應程度的劑量下，能夠延長分化好/去分化脂肪肉瘤患者的無進展生存期，中位無進展生存期可達17.9周[28]。

CDK4抑制劑在骨肉瘤等肉瘤治療中的探索仍處于初期階段[10,29-32]，目前關于骨肉瘤和CDK4基因的研究關注的是CDK4基因和MDM2基因在骨肉瘤中的表達和臨床意義。研究表明，在高級別骨肉瘤或低級別骨肉瘤的去分化區域，CDK4和MDM2共同高表達，在骨膜骨肉瘤、皮質旁骨肉瘤等低級別骨肉瘤中也可特異性表達，用于輔助影像學/臨床表現不典型或樣本量有限病例的病理診斷。此外，CDK4在轉移性骨肉瘤組織中的表達水平顯著高于非轉移性骨肉瘤組織，且在轉移灶中的表達水平顯著高于原發灶。以上研究表明CDK4高表達與骨肉瘤患者預后不良相關[18,33-35]。本實驗通過構建pEGFP-CDK4重組質粒，從CDK4的功能出發，驗證了CDK4對骨肉瘤增殖和遷移的關鍵作用。以上結果表明CDK4在骨肉瘤的發生發展中起著重要作用，值得進一步研究。

因此，本研究成功構建出pEGFP-CDK4重組質粒，將pEGFP-CDK4質粒轉染至骨肉瘤MG63細胞中。蛋白質免疫印跡結果表明pEGFP-CDK4成功轉染至骨肉瘤細胞中并表達，免疫熒光驗證CDK4定位在MG63細胞的細胞核中。CCK-8實驗、克隆形成實驗及劃痕實驗的結果，都證明了過表達CDK4可以增強MG63細胞的增殖和遷移能力。本研究內容驗證了CDK4基因在骨肉瘤中的關鍵作用，為今后進一步研究CDK4抑制劑在增強骨肉瘤治療效果中的作用奠定了重要的研究基礎。

作者貢獻李健雄、韓雨辰：文獻調研，實驗實施，文章撰寫；杜祎萌：協助文獻調研，實驗實施；薛春源、鄭亞男、亢小峰、房廖鑫：協助實驗實施；畢文志、徐小潔、許猛：論文選題，實驗指導，文章審閱及修改。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突。

數據共享聲明本論文相關數據可依據合理理由從作者處獲取，Email：ljianxiong301@163.com。