丹東草莓根腐病病原菌鑒定及生物學特性研究

陳曉旭鄭亞娟王作英王應玲趙睿杰那明慧

(1.丹東農業科學院,遼寧 鳳城 118100; 2.遼寧省玉米育種重點實驗室,遼寧 鳳城 118100; 3.凌源市溝門子鎮人民政府,遼寧 凌源 122000)

遼寧丹東是全國最大的草莓生產和出口基地,“丹東草莓”獲國家農產品地理標志保護,現品牌價值達77.5 億元,位居全國第一[1]。 由于草莓種植區土壤連作情況嚴重,重茬地增多導致草莓根腐病發生逐年加重,是制約丹東草莓發展的重要因素之一[2]。 雖有研究表明,引起草莓根腐病的主要病原菌包括立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、草莓疫霉(Strawberryphytophthora)及大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)等20 余種土傳病原真菌,但目前丹東地區草莓根腐病致病菌種類尚未報道[3～7]。因此,準確鑒定引起丹東地區草莓根腐病的致原菌,對該病害的防治及抗病育種工作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草莓病株采集于2021 年丹東東港、丹東鳳城等地草莓種植基地,共采集10 份。

1.2 致病菌的分離純化

采用常規組織分離法進行致病菌的分離:使用無菌水對病樣進行清洗晾干后,對發病部位橫切0.5 cm 小段,取病健交界處縱向切薄塊,75%酒精消毒30 s,無菌水洗滌2 次,1%次氯酸鈉浸泡3 min,無菌水洗滌3 次,無菌干燥濾紙吸干病樣表面的水分。 置于PDA 平板28 ℃倒置培養。

純化:待分離平板長出菌落后,取菌落邊緣新生菌絲置新的PDA 平板上進行培養,反復進行操作,直至平板菌落一致,分離菌株純化完畢。

1.3 分離菌株致病性測定

使用干熱滅菌處理的基質盆栽培養脫毒草莓苗,分離菌株使用PD 培養基28 ℃、150 r/min 培養5～7 d,菌液打碎稀釋后對健康草莓植株進行接種。

接種:上述菌液稀釋至含孢子5×107個/ml以備接種,使用注射器針頭對健康草莓苗根部做傷口處理,取菌液5 ～10 ml 澆灌在莖附近土壤表面,保濕培養。 接種無菌水做為對照處理,每處理接種5 株草莓苗。

1.4 病原菌的形態學鑒定

采用魏景超的真菌鑒定方法對病原菌進行形態學鑒定,將病原菌平板4 ℃處理7 d 后,室溫放置30 min,挑取少量菌絲懸浮于滴加無菌水的載玻片上,用高倍鏡觀察病原菌分生孢子形態。 從病原菌的菌絲、菌絲分枝、孢子等形態特征來進行分類鑒定。

1.5 病原菌的分子生物學鑒定

取適量純化的病原菌菌絲,采用CTAB 法提取菌絲基因組DNA。 借助真菌ITS 區域通用引物(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和鐮刀菌延伸因子-1α 蛋白(elongation factor 1α,EF-1α)特異性 引 物 ( TEF1-αF: 5 ’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’; TEF1-αR: 5 ’-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3’)對分離菌株的ITS 序列和TEF-1α 序列進行擴增,擴增產物送由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。 測序結果經NCBI 數據庫進行同源性比對。 選取與病原菌EF-1α 序列同源性高的菌株序列,利用MEGA 4.0 軟件構建系統進化樹。

1.6 生物學特性研究

1.6.1 溫度 依據實際棚內環境分別設置5、10、15、20、25、30、35 ℃共7 個溫度梯度,采用PDA 平板培養致病菌株,每處理重復5 次。 十字交叉法測量菌落直徑,并進行統計分析。

1.6.2 不同pH 值 依據實際棚內土壤pH 值設置5、6、7、8、9 共5 個pH 梯度,用鹽酸和氫氧化鈉調節培養基酸堿度,配制成不同pH 值的培養基,制成平板25 ℃下恒溫培養致病菌株,每處理重復5 次。 十字交叉法測量菌落直徑,并進行統計分析。

1.6.3 光照 設置3 種處理:24 h 全光照、24 h全黑暗、12 h 光照12 h 黑暗。 采用PDA 平板培養致病菌株,每處理重復5 次。 十字交叉法測量菌落直徑,并進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 田間發病癥狀

2021 年在丹東鳳城地區、東港地區通過草莓病害調查發現,發病植株葉片枯黃萎蔫,根系表面呈黑色,側根不定根少或無,莖基部橫切,可見中心至邊緣處呈赤褐色。

2.2 病原菌形態學鑒定

分離純化得到14 株菌株,形態學鑒定為同一種菌株,命名為SRR-1,菌落呈圓形、氣生菌絲白色絨狀、邊緣整齊、輪狀向外擴展,菌落背面呈深黃色至淺黃色。 鏡檢下小型分生孢子數量較多,大多為卵形或者腎形,單孢,假頭狀著生于分生孢子梗上;大型分生孢子為馬特形,兩端鈍圓,頂孢稍彎,有隔膜,多為2 ～3 個隔;分生孢子梗為瓶狀,細長。 根據菌株形態學特征,參考Booth《鐮刀菌屬》分類系統進行鑒定,初步將SRR-1 鑒定為茄腐鐮刀菌。

圖1 草莓根腐病田間癥狀

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

提取病原菌DNA,采用真菌ITS 區域通用引物ITS1、ITS4 擴增獲得一條600 bp 左右的片段,基因測序后經BLAST 比對發現,該病原菌屬于鐮刀菌屬。 使用鐮刀菌通用測序引物TEF1-αF/TEF1-αR 擴增獲得一條700 bp 左右的片段,基因測序后經BLAST 比對顯示該病原菌與茄腐鐮刀菌F.solani相似度達100%。 基于TEF1-α 序列構建發育樹。

2.4 草莓根腐病病原菌的致病性

健康草莓植株接種病原菌,14 d 左右草莓葉片邊緣出現萎蔫,葉尖干枯,莖稈持續變紅,植株活力不足,21～48 h 后整株萎蔫,與田間癥狀表現一致,取根部沖洗,發現側根、須根變少變黑。 莖基部縱切發現黑褐色。 依據柯赫氏法則再次分離菌株與接種的病原菌一致,表明茄腐鐮刀菌為草莓根腐病致病菌。

2.5 溫度對菌絲生長的影響

丹東地區溫室草莓一般9 月初左右定植,持續到次年4 ～5 月,棚內溫度基本在10 ～30 ℃之間。 因此,將接種好的菌落平板分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養箱培養。 結果表明病原菌菌絲生長最適宜溫度在25 ～30 ℃。 低于15 ℃或高于35 ℃菌絲生長較慢(圖5)。

圖2 草莓根腐病致病菌的菌落形態、菌絲和分生孢子

圖3 基于ITS 序列構建的發育樹

圖4 草莓根腐病致病菌的致病性

圖5 溫度對菌絲生長速率的影響

2.6 pH 對菌絲生長的影響

將病原菌接種于不同pH 的培養基中28 ℃恒溫培養,結果表明pH 5～8 之間,菌絲均能正常生長(圖6)。

圖6 pH 值對菌絲生長速率的影響

2.7 光照條件對菌絲生長的影響

草莓根腐病致病菌株SRR-1 在24 h 黑暗條件下生長最快,其次是光暗交替環境下,菌落直徑分別為7.78 cm 和7.73 cm。 全光照下生長最慢,菌落直徑為7.47 cm(圖7)。

圖7 光照對菌絲生長速率的影響

3 結論與討論

本研究通過對丹東地區草莓根腐病病株采樣,經組織分離得到菌株14 株,形態學鑒定為同一種菌株,柯赫式法則驗證為草莓根腐病致病菌,通過形態學和分子生物學等技術流程,鑒定該菌株為茄腐鐮刀菌;生物學特性研究表明:茄腐鐮刀菌菌絲生長適宜溫度在25～30 ℃、最適宜酸堿度在pH 5～8、24 h 黑暗條件下菌絲生長速率最快。

草莓根腐病在國內外有不同程度的研究報道,引起草莓根腐病的主要病原菌包括立枯絲核菌(R.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)等20 余種土傳病原真菌,從而導致草莓根腐病藥劑防治效果不明顯。 本研究鑒定了茄腐鐮刀菌可引起草莓根腐病的發生,為丹東地區草莓根腐病防治提供有力依據。 茄腐鐮刀菌在西班牙被鑒定為引起草莓等幾種作物根腐病的病原菌[8～9],重慶地區茅蒼術根腐病的主要病原菌是茄腐鐮刀菌[10],茄腐鐮刀菌可以在土壤中長期存活從而增加病害侵染的風險。 丹東地區草莓根腐病的主要致病菌是茄腐鐮刀菌,是否存在其他致病菌種類,還有待進一步分離鑒定。 針對草莓根腐病病原菌茄腐鐮刀菌的高效防治藥劑篩選有待進一步研究。 在草莓栽培過程中,要加強田間管理,合理調控溫濕度及土壤酸堿度,及時清理病株枯葉,病害高發期選用廣譜型藥劑做好預防工作。