沼液還田對青儲玉米田土壤和微生物菌群的影響

杜建濤李 靖韓 非田 禹王 兵

(1.北京泰克美高新技術有限公司,北京 100160; 2.泰克美生物科技(喀左)有限公司,遼寧 喀左 122306)

隨著我國生豬養殖規?；M程加快,越來越多的豬場糞污需要被集中處理。 無害化及資源化處理豬場糞水是我國政策鼓勵方向,也是養殖業實現可持續發展的途徑[1]。 豬場糞污常見的處理方式是將糞污進行固液分離,糞液經過厭氧發酵處理實現無害化后進行儲存和資源化利用,糞渣則經過堆漚形成有機肥或有機營養土還田[2]。 糞液在厭氧處理過程中,糞污中有機污染物降解產生甲烷等氣體,而氮、磷、鉀等成份幾乎不變。 因此,豬場糞污沼液是一種含有豐富營養和厭氧微生物的液體。研究表明,沼液廣泛應用于灌溉、病蟲害防治、浸種等方面,能夠有效提高農作物產量、提高農產品中有效成分的含量,減少病蟲害等[3]。 也有研究表明使用沼液對土壤的改良具有一定效果[4]。

土壤中微生物是土壤的重要組成部分,其生物量、微生物種類、組成等是衡量土壤質量、土壤肥力和土壤健康與否的重要指標[5]。 微生物菌群的組成和分布會直接影響土壤碳、氮循環及其他營養物質的循環和代謝[6]。

沼液還田會對土壤的營養成分、理化性質、機械組成、微生物菌群等產生一定的影響,進而影響種植在土地上的作物的產量、品質等方面[7]。 基于以上研究,本研究通過連續3 年的青儲玉米田沼液還田試驗,研究沼液還田對土壤養分、理化指標及微生物菌群變化,以期為規?；i場糞污科學、安全的資源化利用和化肥替代提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

青儲玉米地位于內蒙古烏蘭察布市興和縣打拉基廟村,屬中溫帶大陸性季風半干旱氣候,灘川地,平均溫度4.2 ℃,年積溫2 300 ℃,年降雨400 mm 左右,年平均蒸發量為2 036.8 mm,為年降雨量的5 倍。 青儲玉米試驗田種植為一年一季,初始土壤類型為沙壤土。 土壤初始有機質16.7 g/kg、全氮0.93 g/kg、全磷0.8 g/kg、有效磷16.8 mg/kg、速效鉀59 mg/kg、全鹽量0.7 g/kg、pH 值為8.11。

1.2 試驗設計

試驗沼液來自內蒙古烏蘭察布大北農農牧食品有限公司興和分公司母豬場的儲存塘。 豬場糞污以水泡糞方式收集后,經過固液分離、厭氧發酵和儲存塘處理實現無害化。 還田沼液COD 3 520 mg/L、總氮940 mg/L、全磷21.4 mg/L、氨氮837 mg/L、全鉀728 mg/L、全鹽量4 180 mg/L、pH 值8.0。 沼液通過預埋管道輸送至青儲玉米地。

試驗前將土地地勢平整,選用種植習慣和管理方式一致的整塊地劃分為15 塊等面積區域,每塊區域長20 m,寬10 m。 按照等量氮磷鉀施肥的原則設置5 組試驗處理,分別是:空白對照組(CK)、化肥組(C1)、沼液與化肥1 ∶1 組(C2)、沼液與化肥4 ∶1 組(C3)和沼液組(C4)。 每個試驗組(不同處理組)間設置了0.5 m 的隔離帶,每組設置3 個重復。 基于青儲玉米氮磷鉀年需求量,在播種前10～15 d,按照總氮量25 kg/667m2、磷16 kg、鉀10 kg 比例對試驗組進行沼液和(或)化肥添加。 其中,氮肥的來源為尿素,磷肥采用過磷酸鈣,鉀肥則采用氯化鉀。 在青儲玉米生長至11 ～12 片葉期追施沼液或尿素,按照各試驗區域和試驗方案計算各試驗區所需的沼液用量,沼液或肥采用隨水灌溉的方式進行施肥。

1.3 樣品采集及分析方法

在青儲玉米采收期進行土壤樣品采集。 在各處理每個重復地塊分別以“S”形多點混合法采集5 處土壤10 ～20 cm 土樣,隨后將5 組、3 重復取樣點采集的樣品進行混合后,均勻分成兩份。 一份風干后,用于檢測理化性質和營養成分指標[8～10],另一份置入封口袋中于-20 ℃低溫保存,用于檢測微生物指標。

土壤機械組成檢測方式依據《LY/T 1225-1999 森林土壤顆粒組成(機械組成)的測定》,并按照美國農業部(USDA)土壤質地分級標準和對土壤粒徑進行分級:黏粒(＜2 μm)、粉粒(2～50 μm)、極細砂粒(50 ～100 μm)、細砂粒(100～250 μm)、中砂粒(250～500 μm)、粗砂粒(500～1 000 μm)、極粗砂粒(1 000～2 000 μm)[11]。

微生物菌群法利用16S rRNA 測序方法:將土壤微生物樣本對其指定區域進行PCR 擴增、文庫制備、文庫質檢、定量,使用設定的TAG 序列進行樣本區分。

采用Illumina Hiseq 2500 高通量測序平臺對檢測合格的文庫進行測序,Hiseq/Miseq 測序得到的PE reads 根據overlap 關系,將測序所得的雙端序列拼接、過濾等得到優化序列,基于優化序列進行OTU 聚類分析和多樣指數分析。 將得到的OTU 聚類分析結果,采用在線制圖工具,制成VENN 圖(網址http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be/cgi-bin/liste/Venn/calculate_venn.htpl)。

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel 2013 和Origin 2021 軟件進行統計和分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化

根據土壤的各項營養化學指標和土壤的機械結構檢測結果,如表1 所示。 施用不同比例化肥沼液均改變了土壤的理化指標。 施用不同比例化肥沼液后,土壤中的有機質由初始16.7 g/kg 提高至28.1 g/kg,其中C4 組有機質含量增加了68.3%。 除CK 之外,土壤中的全氮的含量為C3＞C4＞C2＞C1,全磷則為C3＞C2＞C4＞C1,全氮和全氮含量在本試驗中,與施肥處理方式關系不大,且不同處理之間差異不顯著。 不同的是,不同處理的速效鉀和有效磷含量與沼液的添加量呈正相關。 土壤中的可溶性全鹽量隨著沼液的添加增加呈現逐漸累積的現象。 與CK偏堿性土壤相比,施用沼液的各處理pH 呈現明顯的下降趨勢,且沼液在施肥過程中所占比例越高,土壤pH 越低,其中全部施用沼液處理C4 的pH 為7.73。

表1 不同處理土壤理化指標Table1 Soil physical and chemical indexes at sampling sites

結果表明,在不同的處理下,土壤的機械組成有一定的變化,其中黏粒、粉粒、極細砂粒和細砂在土壤中比例在CK 組最高,為91.0%,C1 組最低,為48.1%,隨著沼液的加入和化肥添加比例降低,C2、C3 和C4 中比例呈遞增趨勢,分別為56.7%、64.1%和70.1%。 極粗砂和粗砂的比例是C1 最高,CK 和C4 組最低。 土壤顆粒組成以黏土、細粉粒和細砂粒組成,為黏質砂壤土,土壤黏粒和粉粒所占比例越大,土壤結構越好。 因此在種植青儲玉米過程中,僅施用化肥會造成土壤顆粒變大,而沼液在施肥過程中的添加比例越高,對土壤結構改善效果越明顯。

2.2 沼液還田后對微生物菌群的影響分析

2.2.1 微生物群落的多樣性分析

通過對 Chao1 指數和Observed_species 指數反映土壤微生物的豐度;通過分別對Shannon 指數、Simpson 指數的計算可以統計出微生物的多樣性估計,結果見表2。

表2 微生物的豐度和多樣性指數分析Table 2 Analysis of microbial abundance and diversity index

從表2 可以看出,青儲玉米田地5 個土壤樣品Shannon 指數介于9～11 之間,說明土壤中微生物菌群具有極高的多樣性,有利于土壤微生態的穩定,對土壤中的碳循環、單循環及促進作物對礦物質吸收和利用。 經處理后的4 個樣品與對照組相比,Shonnon 指數、Chao1 指數和Simpon 指數都有不同程度的增長,說明土壤經過處理后,群落的豐富度得到提升,可能是由于沼液中有比較豐富多樣的微生物群落,改變了土壤中的微生物多樣性。 根據表2 數據顯示,土壤中沼液添加比例越高,土壤中群落的豐富度越高,表明沼液中的厭氧微生物不會造成土壤的微生態環境破壞。 5 個樣品中的Coverage 指數值接近1,說明序列被測出的概率很高,測序準度可靠。

2.2.2 微生物群落組成

按照97%序列相似水平,利用QIIME 軟件包中的Uclust 方法進行對測序結果進行OTU 聚類分析。 基于Silva 參考數據庫,對每個樣品的OTUs 進行物種分類學(Taxonomy)注釋,按照“門、綱、目、科、屬、種”分類各自含有的微生物類群數如表3 所示。

表3 各分類水平的微生物類群統計Table 3 Microbial group statistics at different classification levels

統計所有樣本在門、綱、目、科、屬各層次上的分類結果。 基于豐度前10 的物種采用累積柱狀圖比較樣本間的物種組成差異,進行列表展示,樣本在門和綱層次的群落結構分析結果如圖2 所示。 圖中僅展示含量最多的前10 個物種在每個樣本中所占比例關系,同時也展示這些物種在樣品中所占比例,每個柱狀代表1 個樣本,不同色塊代表相應層次的不同的類別。

圖1 土壤樣品的機械組成Figure 1 The mechanical composition of soil simples

由圖2 可知,土壤樣品中主要優勢菌門主要為放線菌門(28.8%)、變形菌門(28.6%)、浮霉菌(15.4%)、酸桿菌門(6.8%)和厚壁菌門(3.6%),總豐度達83.2%,且各處理之間門水平微生物的所占比例存在一定差異。 與CK 組土壤樣品相比,處理地塊C1、C2、C3 和C4 的優勢菌門、放線菌門和變形菌門有所降低,浮霉菌門和酸桿菌門則有明顯的增長。 結合5 個樣品的不同處理,CK 組和C1單一施用化肥組的優勢菌門比例相近,而添加沼液的C2、C3 和C4 組微生物組成結果比較相似,優勢菌門比例相近,放線菌門和酸桿菌門所占比例隨著沼液比例提高而增加,厚壁菌門則有所降低。

從微生物總量相對豐度的優勢菌綱層次對比,如圖3所示,優勢菌綱所占比例由高到低分別為α-變形菌綱、放線菌綱、浮霉菌綱、酸桿菌綱亞組和β-變形菌綱,各處理微生物總量從綱層面無顯著差異,對照組CK 與處理組C1、C2、C3 和C4 組相比,α-變形菌綱和嗜熱菌綱略降低,酸桿菌綱亞組、浮霉菌綱和放線菌綱有所升高,相互之間差異不明顯。

圖3 各樣地土壤細菌 OTUs Venn 圖Figure 3 OTUs Venn diagram of various soil bacteria

通過將各處理土壤樣品分布的OTU 為依據,對各個土壤樣品的細菌菌種的多樣性進行相關分析。 通過制成的VENN 圖可以得知,5 個樣品共有OTU 數目為2 739,除CK 和C1 特有OTU 數為0 之外,C2、C3、C4 特有OTU條數分別是1、2、1。

由此可見,沼液還田不會大幅度增加土壤微生物的種類,基本不影響原有土壤微生物系統。

結合來自5 個不同區域的土壤的微生物測序結果,從門層次和綱層次柱狀圖并結合根據OTU 數制得VENN圖,初步可以得出結論,即施用沼液不會破壞土壤中原有生態系統,促進土壤微生物多樣性,維持土壤生態系統穩定。

3 討論

土壤是植物生長的所依賴的基礎,土壤理化性質指標反映出土壤的肥力,土壤顆粒組成決定了養分和水分的保持能力和運轉能力;土壤中微生物群落的組成則衡量土壤質量的標準之一[12]。 本試驗表明,連續兩年施用不同肥料和不同比例的沼液后,青儲玉米田地表層有機質、總氮有著不同程度的提高,而土壤的pH 則是隨著沼液施用比例增多,pH 從8.11 降至7.73 左右,而施用化肥的處理pH 為8.32,分析可能是沼液中的有機污染物成份進入土壤后,提高了土壤中有機質和總氮的含量,同時有機質的增加提高了微生物活性和促進了腐殖質等酸性物質的生成,使得土壤pH 降低。 本試驗在進行過程中,發現全磷、有效磷、有效鉀的含量并未呈現一定的規律性,全部使用沼液作為肥料的C4,土壤中的有效磷、速效鉀含量最低,分析可能是沼液還田時,大量的水分擴大了各種鹽分在土壤中的分布范圍,造成濃度的降低,也可能與沼液中有機物的添加有關,促進了微生物對礦物質的轉化,更有利于作物對磷的吸收。

土壤機械組成與土壤的水土保持、養分保持密切相關。 本試驗反映了沼液處理后的土壤粒徑黏粒和粉粒比例增大,而使用化肥的則是粗砂和極粗砂的比例增多,可能是施用沼液后土壤有機物的增加,改善了土壤的團粒結構[13]。 該結論也與(蘇志珠,2008)等發現一致[14],有機物土壤有機質的含量與粉粒和黏粒的含量呈正相關關系,與砂粒則呈負相關。

微生物群落組成是衡量土壤健康和質量的重要指標[15],不同區域,不同處理條件下細菌群落存在差異[16]。本次試驗,通過利用化肥和沼液按照不同比例進行處理,土壤中優勢菌群放線菌門、變形菌門和浮霉菌門所占比例介于72%～74%之間,其中變形菌門隨著沼液在施肥比例中不斷增加而略下降,而放線菌門則隨著沼液在施肥比例中不斷增加而上升。 由于變形菌門具有較強的固氮作用,沼液的添加可能影響了土壤內部的氮循環過程[17]。放線菌門具有分解土壤中有機物的能力,在土壤碳礦化過程中發揮著重要作用[18]。 浮霉菌門作為一種生態友好型微生物,能夠參與土壤的反硝化過程;酸桿菌門是土壤菌群中一大門類,目前對其機理和作用尚未明確,一般認為跟土壤植物纖維降解和鐵循環有關[19]。 厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度則與沼液比例呈負相關,厚壁菌門具有較強的環境適應性,能夠生存在干旱和鹽堿等較為極端的區域,有利于分解土壤中難降解化合物,預防植物病蟲害,在土壤生態系統中發揮著重要的生物學作用[20]。 擬桿菌則是一種相對耐氧的厭氧微生物菌群,沼液的添加一定程度上改變土壤的營養環境及氧氣含量,進而影響厚壁菌門和擬桿菌門與其他微生物菌群之間的競爭關系。

土壤施加沼液在一定程度上能夠增加土壤微生物菌群的多樣性[21];通過VENN 圖發現,經過3 年沼液和肥料處理,土壤樣品中新增微生物門類較少,C1、C2、C3 和C4四組處理中,C1 與CK 種類相同,C2 和C4 分別比CK 多1種,C3 則比CK 多了2 種,與2 749 種共有微生物種類相比,差異很小。

4 結論

本研究顯示,土壤施用沼液在一定程度上可以提高土壤的有機質、全氮的含量,降低土壤pH 值。 根據不同處理后的土壤的機械組成分析發現,連續施用化肥的土壤種,含有粗砂和極粗砂比例占比更高,施用沼液田地,土壤中的黏粒和粉粒占比更大,屬于粘質壤土。 通過對比各種處理的微生物菌群,施用沼液比例越大,對土壤表層的群落結構有一定的影響[22]。 與不經任何處理的土壤相比,土壤中變形菌門和放線菌門相對豐度略有下降,隨著沼液添加比例上升,放線菌門相對豐度反彈,同時酸桿菌門和浮霉菌門有較為明顯的上升趨勢,表明沼液和肥料中的養分進入土壤后,對土壤的微生物菌群結構產生了一定的影響,VENN 圖顯示,沼液或肥料的施用不會大幅度增加土壤微生物菌群種類,保持土壤微生物生態基本穩定。 本研究揭示了長期沼液還田灌溉對青儲玉米田地的理化性質和微生物菌群多樣性的影響,有助于進一步推動沼液安全高效還田,了解沼液灌溉對土壤微生物環境產生的影響。