骨化三醇通過B細胞受體/PI3K/AKT/NF-κB通路抑制大鼠高原肺水腫的發生*

戴重陽 林 雪 王雅軒 呂中奎 朱夢婷 鄧章昌 蒲小燕

（青海大學醫學院基礎醫學部組織學與胚胎學教研室，西寧 810016）

高原肺水腫（high altitude pulmonary edema）是由于急性暴露于高海拔缺氧環境而導致肺部液體積聚的一種高原疾病，通常在海拔上升到2 500～3 000米以上的2～4 d內發生。高原肺水腫可導致呼吸困難、運動不耐受、疲勞、咳嗽和發紺，如果不及時治療，可能會危及生命[1-2]。目前對高原肺水腫的治療包括乙酰唑胺、紅景天等抗高原反應藥物，但其治療仍然有很大的局限性[3]。針對高原肺水腫的防治藥物亟待開發。骨化三醇即1，25二羥基維生素D3[1，25-（OH）2-D3]能抑制平滑肌細胞的增殖，通過調節氣道平滑肌相關基因的轉錄，使氣道重塑和炎癥反應減輕[4]。此外，筆者前期測序研究發現骨化三醇改善高原肺水腫與補體和凝血級聯通路相關[5]。研究表明，補體和凝血級聯通路的下游通路是B細胞受體（B cell receptor，BCR）信號通路。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）是BCR信號通路下游的重要效應因子，可導致早期基因的表達，并進一步激活參與B細胞增殖、分化及其他過程的其他基因表達[6]。因此，筆者推測骨化三醇改善高原肺水腫可能與B細胞受體/PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路相關。本研究旨在探討骨化三醇對高原肺水腫發生的抑制作用及機制，為骨化三醇防治高原肺水腫提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康SD雄性大鼠30只，體質量200～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2021-0011。大鼠飼養于青海大學實驗動物房，飼養條件為溫度 25℃±2℃，濕度50%～60%，自由飲食、飲水，定期更換墊料、清理消毒鼠籠。本研究經青海大學醫學院實驗動物倫理委員會批準，所有實驗操作均嚴格按照還原、細化、替代的3R原則進行。

1.2 主要試劑

骨化三醇軟膠囊（國藥準字：H20143142）購自正大制藥（青島）有限公司；TUNEL試劑盒購自瑞士羅氏公司；B細胞活化因子（B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素-6（interleukin 6，IL-6）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素-4（interleukin 4，IL-4）、白介素-10（interleukin 10，IL-10）ELISA試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司；一抗CD21購自英國Abcam；一抗人核因子κB抑制蛋白α（NF-kappa-B inhibitor α，IkBα）購自北京博奧森；HRP標記山羊抗兔IgG二抗、FITC-Tyramide購自武漢塞維爾生物科技有限公司；PI3K兔克隆抗體、AKT兔克隆抗體、p-AKT兔克隆抗體、IkBα兔克隆抗體、p-IkBα兔克隆抗體購自武漢Abclonal；p-PI3K兔克隆抗體購自英國Abcam。

1.3 高原肺水腫大鼠模型構建及分組

大鼠適應性飼養1周后，隨機將大鼠分為常氧組、低氧組、低氧+骨化三醇組，每組10只。常氧組和低氧組灌胃等體積生理鹽水；低氧+骨化三醇組灌胃骨化三醇（骨化三醇軟膠囊以體積比60∶10∶30溶解于丙二醇、乙醇和水的混合溶劑中，最終配置成濃度為0.252 μg/kg的骨化三醇溶劑），各組均每日灌胃1次，連續5 d。第6天常氧組大鼠繼續飼養在實驗動物房，低氧組、低氧+骨化三醇組大鼠置于模擬海拔6 000 m低氧環境的低壓氧艙內（大鼠進艙后以10 m/s速度減壓上升，10 min達到海拔6 000 m，氧含量9.8%），之后維持氧含量在9.7%～9.9%之間，艙內大氣壓維持在46.57～49.02 kPa范圍內，濕度維持在49%～55%之間。室內溫度由中央空調統一控制，白天保持在22℃～24℃，夜晚保持在16℃～18℃飼養48 h。飼養結束后，將低壓氧艙內的海拔降至3 500 m，并在實驗艙進行大鼠樣本取材。

1.4 樣本采集

低氧組大鼠低氧脅迫48 h后，以斷頸法迅速處死大鼠，摘取完整肺組織，左肺上葉用于測定肺含水量，左肺下葉-80℃保存，右肺組織采用10%中性甲醛溶液固定；常氧組同一時間按上述方法在常氧條件下取材，并進行后續檢測。

1.5 肺含水量測定

采用干濕比重法測定肺含水量，左肺上葉稱重后放入55℃烘箱中，直至干重的稱重誤差在0.000 2 g以內。肺含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 H-E染色觀察肺組織病理變化

取經10%中性甲醛固定的肺組織，石蠟包埋制作病理切片（5 μm），H-E染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變情況。根據肺組織炎癥判斷標準進行炎癥評分[7]：0分為無炎癥反應；1分為輕度炎癥，支氣管或血管壁及肺泡間隔內有炎癥細胞灶；2分為中度炎癥，支氣管或血管壁及肺泡間隔內有片狀炎癥或局限性炎癥，面積＜1/ 3；3分為重度炎癥，支氣管或血管壁及肺泡間隔內有彌漫性炎癥細胞，面積在1/3～2/3之間。

1.7 TUNEL法檢測肺組織細胞凋亡

取經10%中性甲醛固定的肺組織，石蠟包埋，切片（5 μm），檸檬酸鹽緩沖液微波修復，熒光TUNEL孵育液37℃孵育，DAPI襯染，甘油明膠封片。采用Pannoramic 250數字切片掃描儀進行掃描采集圖像，再根據組織大小采集3個區域9張圖像，進行凋亡細胞分析。

1.8 免疫熒光染色觀察肺組織CD21和IκBα的表達

取經10%中性甲醛固定的肺組織，石蠟包埋，切片（5 μm），將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復，3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，山羊血清封閉液封閉，滴加一抗CD21（1∶100）4℃過夜，滴加HRP標記的二抗（1∶100）室溫孵育30 min，加入FITC-Tyramide（1∶500）室溫孵育10 min；將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復，滴加一抗IκBα（1∶100）4℃過夜，滴加熒光二抗（1∶100）室溫孵育30 min，滴加DAPI室溫孵育10 min，使用抗熒光衰減封片劑封片。顯微攝像系統對切片進行圖像采集，采用Image-J圖像分析系統測定所采集全部圖像的熒光強度。

1.9 ELISA檢測肺組織BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10含量

取-80℃保存的肺組織，勻漿，10 000 r/min離心10 min后取上清液，采用ELISA試劑盒步驟檢測肺組織BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10含量。

1.10 免疫印跡檢測肺組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα表達

取-80℃保存的肺組織，從樣本中提取總蛋白，并測定蛋白濃度，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDA-PAGE）分離等量的蛋白質，并轉移到聚丙烯酰胺二氟（PVDF）膜上。將膜在室溫下用5%的脫脂牛奶阻斷2 h，用一抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IκBα、p-IκBα（1∶2 000）或β-actin（1∶50 000）孵育膜在4℃下搖晃過夜。第2天用生物素化山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，并使用增強化學發光試劑顯影，檢測所有條帶的灰度值，結果以目的蛋白相對表達量表示。

1.11 統計學處理

使用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析。符合正態分布的計量數據以±s表示，采用單因素方差分析進行比較，兩組間均數比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨化三醇對高原肺水腫大鼠肺質量、肺含水量的影響

與常氧組比較，低氧組肺組織濕重、干重及含水量均明顯升高（P＜0.05）；與低氧組比較，低氧+骨化三醇組肺組織濕重、干重差異無統計學意義（P＞0.05），但肺組織含水量明顯降低（P＜0.01）（表1）。

表1 各組大鼠肺質量、肺含水量變化（n=10，±s）

表1 各組大鼠肺質量、肺含水量變化（n=10，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs常氧組；△△P＜0.01 vs低氧組

組別肺組織濕重（g）肺組織干重（g）肺組織含水量（%）常氧組0.16±0.020.12±0.0274.18±0.91低氧組0.21±0.03*0.16±0.03**77.82±0.95**低氧+骨化三醇組0.19±0.030.14±0.0274.73±0.66△△

2.2 骨化三醇對高原肺水腫大鼠肺組織病理變化的影響

常氧組大鼠肺組織表面被覆漿膜，未見明顯水腫、炎癥細胞浸潤或纖維結締組織增生。低氧組大鼠肺組織見輕微肺泡隔增寬，細胞成分增多，可見少量肺泡上皮細胞增生，間質內少量炎癥細胞浸潤及少量纖維組織增生，肺泡腔輕度擴張，可見肺泡間隔變窄，細胞成分減少，肺泡上皮細胞水腫。低氧+骨化三醇組大鼠肺組織少量肺泡上皮細胞水腫，細胞質淡染，細胞體積增大，且少量肺泡上皮細胞脫落于肺泡腔內，間質內少量炎癥細胞浸潤（圖1A～1C，見封二）。與常氧組比較，低氧組肺組織炎癥評分及細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）；與低氧組比較，低氧+骨化三醇組肺組織炎癥評分及細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）（圖2A～2C，圖4A、4B）。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化，H-E染色，A1～C1：×100，標尺=200 μm；A2～C3：×400，標尺=50 μm。A：常氧組；B：低氧組；C：低氧+骨化三醇組.

圖2 各組大鼠肺組織TUNEL染色，×400，標尺=20 μm。A：常氧組；B：低氧組；C：低氧+骨化三醇組。A1～C1：Merged；A2～C2：DAPI；A3～C3：TUNEL.

圖3 各組大鼠肺組織CD21和IκBα免疫熒光染色，×400，標尺=20 μm。A：常氧組；B：低氧組；C：低氧+骨化三醇組。A1～C1：Merged；A2～C2：DAPI；A3～C3：CD21；A4～C4：IκBα.

圖4 各組大鼠肺組織病理炎癥評分（A）、細胞凋亡率（B）、CD21熒光強度（C）及IκBα熒光強度（D）比較

2.3 骨化三醇對高原肺水腫大鼠肺組織B細胞活化及炎癥細胞因子的影響

與常氧組相比，低氧組大鼠肺組織BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量明顯升高，IL-4、IL-10含量明顯降低（P＜0.01）；與低氧組相比，低氧+骨化三醇組大鼠肺組織BAFF、TNF-α、IL-6、IFN-γ含量明顯降低，IL-4、IL-10含量明顯升高（P＜0.01）（圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織B細胞活化因子及炎癥細胞因子含量變化

2.4 骨化三醇對高原肺水腫大鼠組織PI3K/AKT/NF-κB信號通路的影響

免疫熒光共染結果顯示，CD21蛋白表達呈現綠色，IκBα蛋白表達呈現紅色，均定位于細胞核。與常氧組相比，低氧組CD21熒光強度明顯升高，IκBα熒光強度明顯降低（P＜0.01）；與低氧組相比，低氧+骨化三醇組CD21熒光強度明顯降低，IκBα熒光強度明顯升高（P＜0.05）（圖3，圖4C、4D）。免疫印跡檢測結果顯示，與常氧組相比，低氧組p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯升高，p-IκBα蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與低氧組相比，低氧+骨化三醇組p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯降低，p-IκBα蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；而各組間PI3K、AKT、IκBα蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）（圖6）。

圖6 各組大鼠肺組織PIK3/AKT/NF-κB信號通路相關因子變化

3 討論

高原肺水腫的發生與缺氧及炎癥有關[8]。研究表明，暴露在高海拔地區的受試者血清中IL-6的水平增加，在暴露的第2天達到峰值[9]。對暴露于低氣壓缺氧條件72 h大鼠的研究顯示，其血清中IL-1β的水平增加[10]。此外，大鼠在急性低氣壓下（3 h、7 620 m）肺部促炎細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10）和中性粒細胞浸潤水平增加[11]。研究顯示高海拔或低氣壓缺氧可影響免疫平衡機制，可能導致與缺氧狀況相關的疾病發生，TNF-α、IL-6、IL-10等促炎細胞因子在早期高原肺水腫中發揮作用，并可能與肺動脈高壓相關[12]。一項研究表明，高原肺水腫大鼠在接受高壓氧療法后，表現出增加組織氧合、改變中性粒細胞功能和損害細菌復制等有益影響，并能特異性地抑制TNF-α和低氧誘導因子-1，從而有利于抗氧化及抗水腫作用[13]。同時，肺組織病理損傷、細胞凋亡率及肺含水量是評價肺水腫嚴重程度的指標[14]。本研究首先測定了骨化三醇對高原肺水腫大鼠肺組織含水量及病理變化的影響，結果顯示骨化三醇減輕肺組織損傷，肺組織呈現少量肺泡上皮細胞水腫及少量炎癥細胞浸潤，且肺含水量明顯降低，表明骨化三醇可以緩解高原肺水腫造成的肺組織損傷。同時，骨化三醇抑制了肺組織中TNF-α、IL-6、IFN-γ含量及肺組織細胞凋亡，增高了IL-4、IL-10含量，這一結果表明，骨化三醇減輕了高原肺水腫大鼠肺組織炎癥反應，該結果與大多數高原肺水腫相關的基礎研究和臨床研究相一致[15-16]。

研究顯示B細胞是適應性免疫的重要組成部分，其產生和分泌數百萬種不同的抗體分子，每一種都能識別不同的外來抗原[17]。BCR是一種由2對膜結合的免疫球蛋白重鏈和輕鏈組成的細胞表面受體，由CD79A（Ig-α）和CD79B（Ig-β）組成的異二聚體與BCR形成復合物，并在細胞內信號轉導中起至關重要的作用[18]。BCR信號轉導集中參與了正常和惡性B細胞的激活、生存和增殖，在抗原刺激下，蛋白酪氨酸激酶（PTKs）-SRC家族激酶LYN、SYK及TEC家族激酶BTK被激活[19]。此外，被激活的SYK會使B細胞核心受體CD19和PI3K磷酸化，這種信號最終直接導致早期基因的表達，進一步激活參與B細胞增殖、分化以及其他過程的其他基因的表達[20]。此外，缺氧可通過刺激NF-κB基因轉錄和促炎細胞因子的產生引起機體的炎癥反應，而BCR可以介導NF-κB途徑的下游激活[21]。筆者前期測序研究顯示骨化三醇改善高原肺水腫與補體和凝血級聯通路相關，而BCR信號通路是補體和凝血級聯通路的下游通路[5]。先前的研究表明，在急性高原肺水腫大鼠中PI3K/AKT途徑被激活，而山柰酚可能通過下調PI3K/AKT信號通路預防低壓低氧誘導的急性高原肺水腫的發生[22]。本研究結果顯示，低氧組BAFF含量、CD21熒光強度、p-PI3K蛋白、p-AKT蛋白表達明顯升高，p-IκBα蛋白表達明顯降低，提示低壓低氧誘導B細胞受體/PI3K/AKT/NF-κB通路激活。經骨化三醇干預后，BAFF含量、CD21熒光強度、p-PI3K蛋白、p-AKT蛋白表達明顯降低，表明骨化三醇可以抑制B細胞受體/PI3K/AKT/NF-κB通路。因此，骨化三醇可能通過抑制B細胞受體/PI3K/AKT/NF-κB通路進而緩解高原肺水腫。

綜上所述，骨化三醇通過抑制炎癥反應可預防高原肺水腫的發生，這種保護作用機制可能與其抑制B細胞受體/PI3K/AKT/NF-κB信號通路有關，這為后續將骨化三醇開發成為防治高原肺水腫的藥物奠定了理論基礎。