不同吸氧濃度對慢性阻塞性肺疾病大鼠環加氧酶2/前列腺素/E-前列腺素類激素信號通路及上皮細胞活性的作用機制*

鄭立風 張 露 趙紅霞 李芳圓 梁金排

（1 衡水市人民醫院呼吸與危重癥科，衡水 053000；2 深州市醫院呼吸與危重癥科，深州 053000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的主要特征為持續性氣流受限且呈進行性發展[1-2]。由于目前治療COPD的藥物療效并不十分理想，因此探究有效治療COPD的方法是目前臨床亟需解決的難題。研究表明[3]，氧氣的吸入可確保COPD患者重要臟器的氧氣供應，但高濃度的氧氣吸入會通過在肺部的氣體交換而造成肺部損傷。但目前關于不同吸氧濃度對COPD大鼠的作用機制未見報道。COPD的發病機制復雜，相關文獻報道氣道炎癥是導致COPD的主要機制，COPD的發病率和死亡率會隨著炎癥加重而增加[4]。環加氧酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）是近年來研究較廣泛的炎癥相關分子之一，其表達會隨著炎癥信號刺激而增加[5-6]。前列腺素E2（prostaglandin E2，PEG2）作為一種炎癥介質可結合E-前列腺素類激素（E-prostanoid，EP）受體，進而啟動下游多種信號轉導途徑[7]。有研究顯示[8]，COX-2/PEG2信號通路可促進煙霧暴露導致的氣道炎癥，但目前關于不同吸氧濃度對COPD大鼠模型中COX-2/PEG2/EP信號通路的變化尚不清楚。因此，本研究旨在探究不同吸氧濃度對COPD大鼠COX-2/PEG2/EP信號通路及上皮細胞活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

50只6～8周齡健康雄性SD大鼠均購自山東省動物實驗中心，合格證號：SCXK2019-0003。大鼠體質量200～220 g，SPF級。將大鼠飼養在統一的動物房內，溫度恒定20℃～24℃，相對濕度為40%～60%，光照12 h一循環晝夜交替，適應性喂養大鼠1周。實驗過程中遵循“3R”原則。

1.2 試劑和儀器

白細胞介素（interleukin，IL）6（IL-6）、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（武漢基因美科技有限公司）；PGE2 ELISA試劑盒（中國聯科生物公司）；COX-2抗體、EP1抗體、EP4抗體、GAPDH抗體（美國Abcam公司）；人支氣管上皮細胞BEAS-2B（上海雅吉生物科技有限公司）；有機玻璃吸氧艙、煙熏箱自制；黃果樹香煙（貴州中煙工業公司）；電熱恒溫箱（廈門鷺基有限公司）；小動物肺功能儀（上海玉研科學儀器有限公司）。

1.3 模型制備和分組

將實驗大鼠隨機分為正常對照組、COPD組、50% O2組、70% O2組、90% O2組，每組10只。本研究根據參考文獻[9]制備COPD大鼠模型。除正常對照組外，其余各組大鼠均置于動物煙熏箱中，恒定煙熏箱中煙霧濃度為450～500 bpm，煙熏時間每次30 min，3 h煙熏1次，煙盒12 h更換1次；同時經煙熏大鼠氣管內滴注脂多糖，每次0.2 mg/kg，連續干預12周。通過檢測大鼠肺功能指標判定COPD模型是否成功。

造模成功后，將5組大鼠均置于自制的有機玻璃吸氧艙內，并控制氧氣流量調節艙內氧氣濃度，正常對照組和COPD組大鼠吸入氧濃度（FiO2）為21%，50% O2組、70% O2組、90% O2組大鼠FiO2分別為50%、70%、90%，吸氧時間均為40 min[10]。

1.4 肺功能檢測

氧療干預結束后，各組大鼠均經腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，消毒頸部皮膚并沿正中位切開，將肌肉組織鈍性分離暴露氣管，插入連接有三通開關的氣管插管并結扎，將大鼠仰臥位置于密閉體積描計器內，和肺功能儀相結合，進行機械通氣。分別記錄各組大鼠吸氣阻力（RI）、肺總量（TLC）、用力肺活量（FVC）、50 ms用力呼氣量（FEV50）。

1.5 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的采集

肺功能檢測結束后，繼續向下剪開各組大鼠頸部皮膚，打開胸腔并充分暴露肺組織，結扎右主支氣管，將灌胃針插入到左支氣管中1 cm并將末端結扎，經灌胃針注入4℃生理鹽水5 mL于左肺，30 s后抽出左肺中3～4 mL的生理鹽水后再注入，重復3次，最后一次抽取液體并置于離心管中。在4℃環境中以3 000 r/min的速度離心液體20 min，收集上清液，用ELISA法檢測BALF中PGE2、IL-6、IL-8、TNF-α水平。將離心管中的細胞沉淀在光學顯微鏡下進行細胞分類計數，分別統計各組巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞的百分比。

1.6 肺組織病理學變化檢測

采集BALF后分離各組大鼠右肺上葉，用4%多聚甲醛溶液固定肺組織，48 h后取出肺組織用石蠟包埋，用切片機將肺組織切成厚度為5 μm的組織薄片，用蘇木精-伊紅（H-E）染色肺組織，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.7 免疫印跡檢測肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達

取各小鼠50 mg肺組織，于冰上裂解組織至組織勻漿，離心組織勻漿，用DAB法檢測上清液中蛋白濃度。分別配置濃縮和分離膠，濃度分別為5%和8%，在膠孔中分別加入樣品蛋白，電泳10 min后轉膜。孵育2 h后，將5%封閉液加入到樣品中，激活后轉移到PVDF膜上，封閉PVDF膜1 h。分別加入一抗COX-2、EP1、EP4過夜，繼續加入HRP標記的二抗，繼續孵育2 h。用ECL檢測細胞PVDF膜并成像。

1.8 香煙煙霧提取物（CSE）制備

取30 mL的RPMI-1640培養液，點燃10根黃果樹香煙后和培養液共同培養，過濾所得懸浮液為CSE溶液，用RPMI-1640稀釋CSE溶液濃度為2.5%，于-80℃的冰箱中保存。

1.9 BEAS-2B細胞培養和處理

將BEAS-2B培養于RPMI-1640培養基中，加入10%胎牛血清，后于37℃、5% CO2的培養箱進行貼壁培養，每隔2～3 d更換1次培養液。當細胞融合生長達到80%～90%時，取處于對數期的細胞進行后續實驗。將BEAS-2B細胞分為對照組（將BEAS-2B細胞培養于正常培養基中，置于常規培養箱中培養）、CSE組（將BEAS-2B細胞培養于含2.5% CSE溶液的培養基中，置于常規培養箱中培養）、50%組（將BEAS-2B細胞培養于含2.5% CSE溶液的培養基中，置于含50% O2的培養箱中培養）、70%組（將BEAS-2B細胞培養于含2.5% CSE溶液的培養基中，置于含70% O2的培養箱中培養）、90%組（將BEAS-2B細胞培養于含2.5% CSE溶液的培養基中，置于含90% O2的培養箱中培養），各組細胞均培養48 h后進行后續實驗。

1.10 CCK-8法檢測細胞增殖活力

取各組BEAS-2B細胞，離心并消化細胞成為細胞懸液，稀釋細胞濃度為2×105個/mL，接種細胞于96孔板內，每孔100 μL，待細胞貼壁生長。培養48 h后棄掉培養液，在孔板內加入CCK-8溶液100 μL，繼續培養細胞2 h，將上清液棄掉，在酶標儀450 nm處測定各孔的吸光度值（A）。

1.11 流式細胞術檢測細胞凋亡

取各組BEAS-2B細胞并消化，接種細胞于6孔板中，當細胞貼壁生長后，更換孔板的培養基。培養48 h后常規消化細胞，離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌細胞，將提前預冷的70%乙醇加入到細胞中，在4℃環境下固定細胞，12 h后再次離心細胞5 min，后再次用PBS洗滌細胞，將含有0.01%的RNase PI染液加入到細胞中，在避光的環境中染色細胞30 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.12 統計學處理

實驗數據采用Graphpad Priam 8.0軟件進行統計學分析。計量資料均用±s表示。不同組間數據采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺功能比較

與正常對照組相比，COPD組大鼠肺功能指標TLC、RI均明顯增加，FEV50/FVC比值明顯降低（P＜0.05）；與COPD組相比，50% O2組和70% O2組大鼠肺功能指標TLC、RI均明顯降低，FEV50/FVC比值明顯升高，且70% O2組肺功能指標變化最顯著（P＜0.05）；與COPD組相比，90% O2組大鼠肺功能指標TLC、RI均明顯增加，FEV50/FVC比值明顯降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠肺功能指標TLC、RI及FEV50/FVC比值比較（n=10，±s）

*P＜0.05 vs正常對照組 ；△P＜0.05 vs COPD組；#P＜0.05 vs 50% O2組

組別TLC（mL）RI（cmH2O·s/mL）FEV50/FVC正常對照組18.62±0.870.11±0.0149.21±1.05 COPD組25.41±1.26*0.18±0.02*35.46±0.82*50%O2組23.47±1.03*△0.15±0.02*△40.17±0.91*△70%O2組20.15±0.92*△#0.13±0.01*△#45.39±0.98*△#90%O2組29.84±1.31*△0.26±0.02*△38.92±0.93*△

2.2 各組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平比較

與正常對照組相比，COPD組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平均明顯升高（P＜0.05）；與COPD組相比，50% O2組和70% O2組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平均明顯降低，且70% O2組降低最顯著（P＜0.05）；與COPD組相比，90% O2組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平明顯升高（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平比較。A：IL-6水平比較；B：IL-8水平比較；C：TNF-α水平比較；E：PGE2水平比較。*P＜0.05 vs 正常對照組；△P＜0.05 vs COPD組；#P＜0.05 vs 50% O2組.

2.3 各組大鼠BALF中白細胞總數和炎癥細胞比例比較

COPD組大鼠BALF中白細胞總數及單核-巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞比例明顯高于正常對照組（P＜0.05）；50% O2組和70% O2組大鼠BALF中白細胞總數及單核-巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞比例均明顯低于COPD組，且70% O2組變化最顯著（P＜0.05）；90% O2組大鼠BALF中白細胞總數及單核-巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞比例均明顯高于COPD組（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠BALF中白細胞總數、單核-巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞比例比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠BALF中白細胞總數、單核-巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞比例比較（n=10，±s）

*P＜0.05 vs 正常對照組；△P＜0.05 vs COPD組；#P＜0.05 vs 50% O2組

組別白細胞總數/（108/L）單核-巨噬細胞（%）淋巴細胞（%）中性粒細胞（%）正常對照組1.35±0.2465.41±2.16 8.11±1.4210.46±2.31 COPD組6.18±0.51*86.25±4.07*16.45±3.56*25.47±4.09*50%O2組4.27±0.42*△81.53±3.62*△13.28±3.11*△19.34±3.26*△70%O2組3.06±0.34*△#72.61±2.82*△#10.31±2.52*△#13.41±2.68*△#90%O2組8.45±0.53*△ 90.14±4.25*△19.26±3.81*△29.65±3.11*△

2.4 各組大鼠肺組織病理學變化比較

與正常對照組相比，COPD組大鼠肺組織損傷明顯，肺泡間隔增厚，且間隔損壞嚴重，在支氣管有大量的粘液腺增生，且大量炎癥細胞浸潤到肺間質，明顯可見肺泡萎縮，管腔變窄，符合COPD的病理學變化；與COPD組相比，50% O2組和70% O2組大鼠肺泡間隔均區域正常，萎縮肺泡及氣管壁粘液腺增生得到明顯改善，炎癥細胞浸潤明顯減少，70% O2組大鼠肺組織病理學改善最顯著；與COPD組相比，90% O2組大鼠肺組織明顯損傷，與COPD組相似（圖2）。

圖2 各組大鼠肺組織H-E染色，×200，標尺=50 μm。A：正常對照組；B：COPD組；C：50% O2組；D：70% O2組；E：90% O2組.

2.5 各組大鼠肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達

COPD組大鼠肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達均明顯高于正常對照組（P＜0.05）；與COPD組相比，50% O2組和70% O2組大鼠肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）；90% O2組大鼠肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達均明顯高于COPD組（P＜0.05）（圖3）。

2.6 各組BEAS-2B細胞活力和凋亡比較

CSE組BEAS-2B細胞活力明顯低于對照組，細胞凋亡率高于對照組（P＜0.05）；與CSE組相比，50%組和70%組BEAS-2B細胞活力均明顯增加，細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與CSE組相比，90%組BEAS-2B細胞活力明顯降低，細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

近年研究發現[11-13]，一定濃度的氧療對COPD疾病可發揮治療作用。氧療可通過提高吸入氣體中氧的濃度而增加機體的氧分壓及氧含量，有效降低無氧代謝和乳酸生成，有效緩解患者肺動脈高壓，同時能使急性加重期的患者達到較為滿意的氧合水平[14]。目前臨床上認為，吸入氧濃度為50%以上時為高濃度氧療，當患者進行長時間的高濃度氧療時可導致患者出現多種不良反應，包括呼吸抑制、吸收性肺不張、氧中毒等。因此眾多學者提出，在給予COPD患者進行氧療時應控制吸氧的濃度，避免以上情況發生。但目前關于COPD患者氧療濃度的控制上尚未見相關報道。

目前臨床上通常使COPD患者先吸入支氣管擴張劑后，再對患者的肺功能指標進行檢測，當發現FEV1/FVC＜0.7時則說明患者存在持續性氣流受限，即確診為COPD。本研究結果顯示，COPD組大鼠肺功能參數TLC及RI參數明顯上升，呼氣流速指標FEV50/FVC比值顯著降低，提示COPD大鼠模型制備成功。50% O2組和70% O2組大鼠FEV50/FVC比值明顯高于COPD組，但90% O2組大鼠FEV50/FVC比值明顯低于50% O2組，提示50%和70%濃度的氧療可明顯改善COPD大鼠氣流受限，但90%濃度的氧療可明顯加重COPD大鼠的氣流受限。Schmidt等[15]研究證實，高濃度的吸氧（FiO2＞90%）可引起肺組織損傷。

研究表明[16]，炎癥反應可涉及慢阻肺患者整個肺及全身，且局部較重的炎癥反應可升高IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子水平，通過破壞肺組織結構和功能而影響肺通氣和換氣，進而降低肺功能并加重疾病進程。相關文獻顯示[17]，IL-6、IL-8可通過誘導巨噬細胞、中性粒細胞聚集、淋巴細胞黏附而釋放炎癥介質，激活氧化應激反應，通過損傷肺實質和肺血管而加重COPD的氣道炎癥反應。本研究結果顯示，50% O2組和70% O2組大鼠BALF中炎癥細胞浸潤明顯低于COPD組，但90% O2組大鼠BALF中炎癥細胞浸潤明顯高于COPD組，提示50%和70%濃度的氧療可改善COPD大鼠炎癥水平，但90%濃度的氧療可明顯加重COPD大鼠炎癥水平并加重肺損傷。朱張求等[18]研究證實，可通過下調COPD大鼠肺部炎癥浸潤而改善大鼠肺部炎癥，減輕COPD疾病進展。

Santini等[19]通過檢測COPD患者呼出氣冷凝物顯示，PGE2含量明顯高于正常對照組，且隨著PGE2含量增高導致COPD病情加重，導致FEV1/FVC值降低。相關研究表明[20]，COX-2、EP4 可顯著降低炎癥中PGE2的含量，因此提示COX-2-EP4信號轉導途徑可能通過PGE2介導多種組織損傷。本研究結果顯示，50% O2組和70% O2組大鼠BALF中PGE2含量明顯降低，肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達也明顯減少，90% O2組PGE2含量和肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達明顯高于COPD組，提示50%和70%濃度的氧療可抑制COX-2/PEG2/EP信號通路的激活，從而抑制氣道炎癥反應的發生，但90%濃度的氧療可促進COX-2/PEG2/EP信號通路的激活。李德富等[21]研究發現，MVE誘導大鼠COPD氣道上皮細胞中COX-2/PEG2/EP信號通路成員明顯增加，同時伴隨NF-κB信號通路的活化。

為證實50%和70%濃度的氧療對COPD大鼠的改善作用，本研究通過體外實驗研究BEAS-2B細胞活性和凋亡率。結果顯示CSE組細胞活力明顯降低，凋亡率明顯增加，50%組和70%組細胞活力明顯高于CSE組，凋亡率明顯低于CSE組，但90%組較CSE組細胞活力明顯降低，凋亡率明顯增加。從體外實驗進一步證實了50%和70%濃度的氧療可改善COPD，當氧療濃度到90%時反而會加重COPD帶來的損傷。

綜上所述，COPD大鼠在氧療濃度為50%和70%時可抑制COX-2/PEG2/EP信號通路的激活，改善COPD大鼠肺功能，減輕肺部炎癥浸潤，增加上皮細胞活性，且70%濃度氧療效果最好；但氧療濃度為90%時會加重COPD大鼠肺部炎癥浸潤，降低上皮細胞活性，促進COX-2/PEG2/EP信號通路的激活。