散結片對肝癌大鼠巨噬細胞極化及MAPK/JNK信號通路的作用機制*

張 遠 董 晶 國 濱△ 徐振華 時 楨 李金芳

（1 廣州中醫藥大學金沙洲醫院，廣州 510080；2 壽光市人民醫院腫瘤放療科，壽光 262700；3 貴州醫科大學附屬醫院，貴陽 550004）

肝癌病因相對較多，目前除與最常見的肝硬化、病毒性肝炎等原因所導致的肝纖維化和硬化有關，還有研究證實其與炎癥及免疫系統紊亂密切相關，而巨噬細胞在其中扮演重要的角色[1-2]。巨噬細胞是一類天然的免疫細胞，具有強大的起源及功能異質性，一般可通過極化轉變自身功能及角色從而發揮作用，其通?？蓸O化為M1型經典活化巨噬細胞及M2型替代性活化巨噬細胞，M1型巨噬細胞可參與炎癥反應，抑制腫瘤免疫逃逸及自身生長，M2型巨噬細胞可促進腫瘤的增殖、侵襲、轉移及新生血管的生成[3]。近年來有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路可參與生長發育、增殖分化、凋亡等多種細胞生理過程的調節，同時有研究表明，該信號通路的轉導異?？赡茉诟伟┑陌l生、發展中發揮重要作用[4-5]。中醫治療肝癌具有廣闊的前景[6]。而散結片是我院根據多年臨床經驗改進而成的中藥抗癌新藥，共湊白鮮皮、海藻、白附子、牛黃等多種中藥材，具有活血化瘀、清熱解毒、軟堅散結之功效，且療效已經得到證實，尤其是對中、晚期肝癌療效顯著[7]。但其具體的作用機制目前尚未明確，因此，本研究就MAPK/JNK信號通路在散結片對大鼠肝癌抑制及巨噬細胞極化的作用機制進行探討，為臨床治療肝癌提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗選取廣東省醫學實驗動物中心提供的40只SPF級SD雄性大鼠，大鼠為裸鼠（合格證書為：SCXK（粵）2019-0017），平均體質量15～25 g，大鼠單籠喂養，室溫生長，模仿12 h晝夜交替，在常溫下進行無菌自由進食、飲水2周，按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。

1.2 儀器與試劑

肝癌細胞（深圳豪地華拓有限公司）；索拉非尼（規格：200 mg/片，秘魯利馬秘魯巔峰藥業有限公司）；散結片（本院中醫部熬制）；SP600125（美國MedChemExpress LLC公司）；CD11c抗體（上?？泼粲邢薰荆?；CD163抗體（北京義翹神州股份有限公司）；全蛋白抽提試劑盒（江蘇凱基有限公司）；SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（江蘇凱基有限公司）；ECL檢測試劑盒（江蘇凱基有限公司）；p38MAPK抗體（上海彩佑實業有限公司）；JNK抗體（武漢菲恩有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Proteintech公司）。

1.3 實驗分組與模型制備

40只SPF級SD雄性大鼠，隨機分為正常組、模型組、索拉非尼組、散結片組，每組10只。對模型組、索拉非尼組、散結片組進行肝癌建模，向各組大鼠的肝葉注射0.5 mL的1×107個/ mL的肝癌細胞懸液，10 d后若超聲觀察到出現腫瘤組織塊，則視為建模成功；正常組不建立該模型，同期給予同體積生理鹽水。建模成功后，對索拉非尼組灌胃68 mg/kg的索拉非尼，對散結片組灌胃12.5 g/kg的散結片，2組均1次/天，持續28 d，每隔4 d記錄大鼠死亡數量，正常組、模型組同期以同體積生理鹽水灌胃。

另取20只大鼠，建模后隨機分為2組，一組給予灌胃50 mg/kg的JNK抑制劑SP600125，記為抑制劑組，另一組給予羅格列酮聯合益氣活血沖劑，記為聯合組。

1.4 標本采集

各組大鼠在實驗結束后使其安樂死，分離腫瘤組織，生理鹽水洗凈后稱重，并對其長徑及短徑進行測量（腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2），同時取大鼠肝組織，用4%多聚甲醛固定96 h，進行常規石蠟包埋、切片處理，處理完成后放入冰箱中密封保存。

1.5 大鼠肝組織的H-E染色

取部分肝組織，二甲苯浸泡15 min，梯度乙醇各浸泡3 min以進行脫水，用蘇木精-伊紅染液進行H-E染色，染色完成后除去多余染液，用梯度乙醇進行脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片，然后用光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.6 巨噬細胞CD11c、CD163免疫組織化學顯色

取各組肝組織切片，進行脫蠟、水化處理，用蒸餾水浸泡2 min后，將切片放入預熱的檸檬酸鹽緩沖液中，用微波爐進行組織抗原修復，修復完成后加入3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，溫室孵育10 min，10%山羊血清封閉2 h，加入CD11c、CD163的一抗（1∶100），4℃過夜，PBS洗滌，加入生物素標記的二抗及辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37℃孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察結果。

1.7 免疫印跡法檢測p38MAPK、JNK蛋白的表達

取各組肝組織，剪碎后加入1 mL RIPA裂解液于冰上充分裂解10 min，在4℃、12 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度，常規轉膜、封閉，加入p38MAPK、JNK一抗（1∶1 000），4 ℃搖床振蕩孵育過夜，PBS洗滌后加入二抗（1∶5 000），37 ℃輕搖室溫孵育2 h；PBS洗滌后用ECL熒光試劑盒測定結果，計算與GAPDH比值求得p38MAPK、JNK蛋白的相對表達含量。

1.8 統計學處理

應用GraphPad Prism 8.0對各組大鼠巨噬細胞標志蛋白及MAPK/JNK蛋白表達進行統計分析，KaPlan-Meier法繪制各組生存曲線，組間比較采用t檢驗、χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，用F表示，計量資料描述采用±s表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠生存和腫瘤生長

與正常組比較，模型組大鼠死亡數量明顯增多（P＜0.05），生存曲線明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，索拉非尼組、散結片組死亡數量顯著減少（P＜0.05），生存曲線顯著升高（P＜0.05），且散結片組比索拉非尼組變化顯著（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠生存曲線

與模型組比較，索拉非尼組大鼠腫瘤質量及體積均顯著降低（P＜0.05）；與索拉非尼組比較，散結片組大鼠腫瘤質量及體積顯著降低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠腫瘤生長情況

2.2 各組大鼠肝組織H-E染色結果

正常組大鼠肝細胞結構正常、形態良好，肝小葉、肝小梁、肝血竇結構清晰完整且排列有序，未見明顯纖維組織增生及炎性細胞浸潤；而模型組可見明顯腫瘤病灶，大部分肝小葉被腫瘤組織代替，且癌變細胞已深染，成空泡樣變，可見纖維組織增生及大量炎癥細胞浸潤；與模型組相比，索拉非尼組、散結片組癥狀明顯改善，癌變細胞數量明顯減少，且散結片組比索拉非尼組改善明顯（圖3）。

圖3 各組大鼠肝組織結構H-E染色，標尺=25 μm。A：正常組；B：模型組；C：索拉非尼組；D：散結片組.

2.3 各組大鼠肝組織中巨噬細胞的極化

與正常組比較，模型組肝組織中CD11c顯著降低（P＜0.05），CD163蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，索拉非尼組、散結片組肝組織中CD11c顯著升高（P＜0.05），CD163蛋白表達顯著降低（P＜0.05），且散結片組比索拉非尼組變化顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠肝組織中CD11c（A1～D1）、CD163（A2～D2）的陽性表達，標尺=25 μm。A：正常組；B：模型組；C：索拉非尼組；D：散結片組；E：各組大鼠肝組織中CD11c、CD163的蛋白表達比較。*P＜0.05 vs正常組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs索拉非尼組.

2.4 各組大鼠肝組織中MAPK/JNK信號通路相關蛋白的表達

與正常組比較，模型組肝組織中p38MAPK、JNK蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，索拉非尼組、散結片組、抑制劑組、聯合組肝組織中p38MAPK、JNK蛋白表達顯著降低（P＜0.05），且散結片組比索拉非尼組降低顯著（P＜0.05），而抑制劑組與散結片組相比差異無統計學意義（P＞0.05），聯合組比抑制劑組明顯降低（P＜0.05）（圖5）。

圖5 各組大鼠肝組織中的p38MAPK、JNK蛋白表達

3 討論

肝癌是常見的消化系統惡性腫瘤，其早期由于病情隱匿，待患者確診時多數都已到中晚期，使得其治療效果及預后極差，從而導致該病已經成為我國惡性腫瘤的第2號殺手[8]。目前現代醫學在治療肝癌方面占據主導地位，但中醫藥在腫瘤治療中同樣不可小覷，中藥具有促進癌細胞凋亡、抑制癌細胞轉移、提高機體免疫功能等多個優勢，因此對于中醫藥靶向治療肝癌的機制也是我們未來發展的方向[9]。

本研究結果顯示，散結片可顯著改善肝癌大鼠病理形態，提高大鼠生存率，并有效降低大鼠腫瘤質量與體積，這說明其具有很好的療效，可顯著抑制大鼠腫瘤生長。索拉菲尼是一種新型多靶向性治療腫瘤的藥物，屬于小分子蛋白激酶抑制劑，其在血管新生中發揮著重要作用，同時是目前唯一被FDA批準用于治療晚期肝癌的靶向藥物，因此本研究用其作為對照組[10]。散結片是我院根據中醫理論及多年臨床實踐經驗研制而成，經過多年實驗研究已證實其對肝癌細胞有顯著的殺傷力及抑制作用[11]。肝癌在中醫中屬于“鼓脹”“肝積”“心積”等范疇，其主要由正氣不足、氣滯血疲、痰濕互結、癌毒稽留、濕熱蘊結所致，故中醫治療肝癌多側重于扶正培本、活血化瘀、清熱解毒、軟堅散結[12]。而對于肝癌大鼠，散結片可能是通過活血化瘀、軟堅散結等功效，來化痰解毒、扶助正氣、補氣養血、祛邪逐癖，從而調節機體陰陽平衡、增強機體免疫力、改善局部微循環，進而抑制原癌基因、促進抑癌基因、抑制癌細胞的核酸與蛋白質合成，抑制過氧化脂質的形成、促進受損黏膜修復等，最終達到抑制腫瘤組織生長、改善患者癥狀、提高生存率的目的。肖正明等[13]研究顯示，散結片具有顯著抑瘤作用，可顯著提高淋巴細胞及吞噬細胞活性，這與本研究結果類似。

本研究結果還顯示，散結片可顯著升高大鼠肝組織中CD11c蛋白表達，降低CD163表達，說明其可誘導巨噬細胞向M1極化，抑制M2極化。已有證據表明，炎癥是絕大多數癌癥的發病根源及后果，其不充分或不完全消退是導致疾病出現的主要原因，肝癌同樣如此，而其中與炎癥反應息息相關的巨噬細胞在癌癥的發生、發展中占有不可忽視的地位[14]。有研究表明，腫瘤浸潤巨噬細胞為M2樣表型，M2型巨噬細胞可介導免疫抑制的形成，從而促進肝癌細胞的生長及轉移，因此如何抑制巨噬細胞向M2型極化一直是腫瘤治療領域的研究熱點[15]。而CD11c和CD163分別是M1型及M2型特異型標志物，通過對其表達的檢測，可明確巨噬細胞極化情況[16]。對于肝癌大鼠，散結片可能是通過影響腫瘤細胞釋放細胞因子，破壞腫瘤微環境的平衡，從而抑制巨噬細胞聚集、浸潤、抑制多種炎性相關通路的激活，進而達到調節機體免疫系統、抑制免疫炎癥反應的目的，最終有效改善疾病癥狀，提高機體免疫力。吳婧婧等[17]研究表明，隨著肝癌進展，M2型巨噬細胞相關蛋白表達顯著升高，說明其可能促進肝癌進展，這與本研究結果類似。

本研究結果顯示，散結片可有效抑制MAPK/JNK信號通路激活。中醫認為包括肝癌在內的腫瘤的發生均可歸納為兩大類因素，即內源性及外源性因素，這些致腫瘤的內、外因素都可能引發機體細胞分化異常、細胞凋亡障礙、信號轉導通路異常等，最終導致肝癌的發生[18]。而MAPK所在通路是信號從細胞表面到細胞核內部一條重要的傳遞途徑，p38MAPK、JNK均是該家族的重要成員，其中p38MAPK被認為是介導炎癥所致多種細胞反應中最重要的激酶，JNK則在細胞因子及應激誘導的細胞凋亡過程中起著關鍵作用[19]。而對于肝癌大鼠，散結片可能是通過抑制病毒與宿主肝細胞內的某些基因序列發生整合，來抑制MAPK信號通路異?；罨?，從而影響表觀遺傳、有效調節細胞周期，進而抑制肝癌細胞生長、誘導肝癌細胞凋亡、促進肝癌細胞分化、抑制腫瘤血管生成等，最終使腫瘤組織停止生長，改善疾病癥狀。Gao等[20]研究表明，多耐藥肝癌細胞中，p38MAPK、JNK的蛋白升高，經過治療后的表達顯著降低，這與本研究結果類似。

綜上所述，散結片可能是通過抑制MAPK/JNK信號通路，抑制巨噬細胞向M2型極化，促進其向M1型極化，進而抑制肝癌大鼠腫瘤生長。但本研究還存在一定局限性，如樣本量小，未單獨進行藥物對大鼠生存情況的影響等，在今后的實驗中將繼續深入研究，以期為臨床提供更多的診療依據。