褪黑素抑制人血管平滑肌細胞的巨噬樣表型轉化

李雙, 譚翠鈺, 侯連杰, 趙國軍

1.大理大學,云南大理 671003;2.廣州醫科大學附屬第六醫院清遠市人民醫院,廣東清遠 511518

心血管疾病的病理基礎為動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)[1],血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)在As發生發展中發揮重要作用[2]。隨著單細胞測序技術和細胞譜系追蹤技術的發展,發現VSMC至少包括6種不同亞型,除了所熟知的收縮表型外,還包括間充質樣、巨噬細胞樣、成纖維細胞樣、成骨樣和脂肪細胞樣表型[3],提示VSMC表型轉化在As發生發展過程中發揮重要且復雜的調控作用。

遺傳譜系追蹤研究表明,小鼠As斑塊中約30%的泡沫細胞來源于VSMC,該比例在人類斑塊中超過40%[4]。水溶性膽固醇負荷導致小鼠原代主動脈VSMC獲得巨噬樣細胞表型,其特征是VSMC標志物表達降低、巨噬細胞標志物上調和脂質吞噬能力增加,細胞發生泡沫化[5]。通過抑制小鼠VSMC的巨噬樣表型轉化,能顯著減少小鼠As斑塊泡沫細胞數量并增加纖維帽厚度,增強斑塊穩定性[6]。褪黑素是由松果體分泌的一種激素,可從調控巨噬細胞極化[7]、降低內皮細胞炎癥反應[8]和抑制VSMC增殖和成骨分化[9]等多方面發揮抗As作用,但褪黑素在VSMC巨噬樣表型轉化過程中的作用未見報道。本研究檢測了褪黑素對VSMC巨噬樣表型轉化相關標志基因表達和細胞脂質吞噬能力的影響,并觀察了褪黑素在VSMC表型轉化所涉及細胞增殖和遷移中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國GIBCO公司,油紅O、水溶性膽固醇(膽固醇∶甲基-β-環糊精復合物)和褪黑素為美國Sigma公司產品,CCK-8試劑盒購于南京建成公司,RNA提取、反轉錄和定量PCR相關試劑均購于TAKARA公司。

1.2 細胞培養

人VSMC系(PCS-100-012)購自ATCC公司。VSMC分為對照組、膽固醇組(水溶性膽固醇)、褪黑素組(水溶性膽固醇+褪黑素)。細胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基,在37 ℃、5%CO2空氣中培養。將VSMC按4×105個/孔接種于6孔板,細胞達80%匯合后,膽固醇組使用終質量濃度10 mg/L水溶性膽固醇處理細胞72 h,每24 h換1次培養基,保證水溶性膽固醇的終質量濃度以誘導血管平滑肌細胞的巨噬樣表型轉化和細胞泡沫化。褪黑素組使用0.5 μmol/L褪黑素與10 mg/L水溶性膽固醇共同處理血管平滑肌72 h。

1.3 CCK-8測定細胞活力

將VSMC按1×105個/孔接種于96孔板中,貼壁生長12 h后,分別用5、10、50、100 mg/L水溶性膽固醇或0.5、5.0、50.0 μmol/L褪黑素分別處理VSMC 72 h,去除細胞培養基,PBS清洗3次,每孔加入90 μL完全培養基+10 μL CCK-8溶液孵育4 h,酶標儀測定450 nm處光密度值。

1.4 定量PCR檢測相關基因表達

按照TAKARA公司RNA提取和反轉錄試劑盒操作說明,提取VSMC總RNA,反轉錄為cDNA,用于后續定量PCR實驗。參考本團隊前期文獻[10]實驗操作,進行實時熒光定量PCR,相關基因引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.5 油紅O染色

接種于6孔板的VSMC在不同因素處理后,PBS清洗2次,500 μL 4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗3次。然后每孔加入500 μL油紅O工作液,避光染色30 min。去除油紅O工作液,通過500 μL/孔60%異丙醇分化10 s,迅速加入1 mL PBS清洗3次。最后,每孔加入500 μL蘇木精染色液染色5 min,用1 mL PBS清洗3次,將細胞置于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 Edu檢測細胞增殖

將VSMC以1×105個/孔接種于24孔板,VSMC在不同處理條件下達到70%匯合后,使用BeyoClick EdU-488細胞增殖檢測試劑盒進行檢測。將細胞置于倒置顯微鏡下觀察、拍照,隨機挑選若干視野拍照,統計視野中Edu陽性細胞率(%)=Edu陽性細胞數/全細胞數×100%。

1.7 細胞劃痕實驗

接種于6孔板的VSMC在不同處理條件下達到90%匯合后,用10 μL移液器槍頭在孔內豎直劃擦,DMEM高糖培養液洗滌細胞,去除懸浮細胞后照相,用不含FBS的DMEM高糖培養液繼續培養。劃痕后第18 h與36 h分別在鏡下觀察劃痕處細胞遷移狀態,并拍照。細胞遷移率通過Image J軟件測量計算。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 褪黑素逆轉水溶性膽固醇誘導的VSMC的巨噬樣表型相關標志基因表達

CCK-8實驗結果表明:≤50 mg/L水溶性膽固醇對VSMC活力無影響;≤5.0 μmol/L褪黑素對VSMC活力無明顯毒性(P>0.05;圖1A和B)。本研究后續實驗選擇10 mg/L水溶性膽固醇和0.5 μmol/L褪黑素。

圖1 褪黑素和水溶性膽固醇對VSMC巨噬樣表型轉化相關標志基因表達的影響A和B為CCK-8實驗;C為定量PCR實驗(n=3)。

定量PCR檢測結果表明:10 mg/L水溶性膽固醇處理顯著降低平滑肌收縮表型相關標志基因α-actin和α-tropomyosin的mRNA水平,并顯著升高巨噬細胞相關標志基因CD68和MAC2的mRNA水平;而0.5 μmol/L褪黑素可逆轉上述趨勢(P<0.05;圖1C),提示褪黑素可抑制血管平滑肌巨噬樣表型轉化相關基因表達。

2.2 褪黑素抑制水溶性膽固醇誘導VSMC脂質蓄積

油紅O染色結果顯示:水溶性膽固醇顯著增加VSMC脂質蓄積,但褪黑素處理后可逆轉水溶性膽固醇對VSMC脂質蓄積的誘導作用(圖2)。

圖2 油紅O染色評估褪黑素和水溶性膽固醇對VSMC脂質蓄積的影響(n=3,400×)

2.3 褪黑素抑制水溶性膽固醇誘導的VSMC增殖

Edu染色結果顯示:水溶性膽固醇增加VSMC Edu陽性率(P<0.05),而褪黑素降低膽固醇引起的VSMC Edu陽性率增加(P<0.05;圖3),提示褪黑素顯著抑制水溶性膽固醇引起的VSMC增殖。

圖3 褪黑素抑制水溶性膽固醇誘導的VSMC增殖(n=3,200×)

2.4 褪黑素對水溶性膽固醇誘導的VSMC遷移無影響

與對照組相比,膽固醇組18 h和36 h細胞遷移率顯著增加(P<0.05),而褪黑素不能減緩水溶性膽固醇共處理引起的細胞遷移率升高(P>0.05;圖4)。

圖4 褪黑素對水溶性膽固醇誘導的VSMC遷移無影響(n=3,40×)

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種由動脈血管內脂質聚積引起的慢性炎癥性疾病,膽固醇誘導的血管平滑肌細胞巨噬樣表型轉化與動脈粥樣硬化易損斑塊形成密切相關,但是目前其分子機制尚未完全闡明。因此,解析VSMC的巨噬樣表型轉化分子機制并探尋相關治療藥物,對于動脈粥樣硬化早期治療及預防不良心血管事件發生具有重要意義。

水溶性膽固醇也叫膽固醇∶甲基-β-環糊精復合物。Rong等[11]研究結果表明,10 mg/L水溶性膽固醇處理小鼠主動脈平滑肌細胞72 h可誘導細胞發生巨噬樣表型轉化,表現為VSMC標志基因α-actin和α-tropomyosin表達顯著降低,巨噬細胞標志基因CD68和MAC2表達顯著增加,且油紅O染色結果顯示VSMC脂質吞噬能力增強。之后,Shankman等[6]也使用水溶性膽固醇處理VSMC,誘導其發生巨噬樣表型轉化,生成泡沫細胞。然而,前期關于水溶性膽固醇誘導VSMC出現巨噬樣泡沫細胞表型的相關實驗模型為原代小鼠主動脈平滑肌細胞,目前尚無水溶性膽固醇處理人VSMC巨噬樣表型轉化的相關報道。本研究先通過CCK-8細胞活力檢測實驗,評估水溶性膽固醇的細胞毒性,發現≤50 mg/L水溶性膽固醇對VSMC活力無影響,且10 mg/L水溶性膽固醇處理即可降低平滑肌收縮表型相關標志基因表達,并升高巨噬細胞相關標志基因表達,此外10 mg/L水溶性膽固醇處理增強血管平滑肌細胞脂質蓄積,提示水溶性膽固醇可誘導人VSMC巨噬樣表型轉化。

VSMC轉分化為巨噬樣細胞過程與VSMC增殖和遷移過程密切相關。VSMC去分化生成間充質樣細胞,隨后發生增殖和遷移。在受到不同刺激后,間充質樣細胞可分別向巨噬細胞樣、成纖維細胞樣、成骨樣或脂肪細胞樣表型轉化[3]。褪黑素是色氨酸代謝的產物,由松果腺按照晝夜節律分泌;近年來研究表明,褪黑素通過調控巨噬細胞極化和降低內皮細胞炎癥反應等多方面發揮抗動脈粥樣硬化的作用[12];因此,本文也觀察了褪黑素對VSMC增殖和遷移的影響,以進一步闡釋褪黑素調控VSMC表型轉化的機制。有研究表明,在ApoE-/-小鼠中,褪黑素通過抑制VSMC炎癥反應和增殖,減緩小鼠As進展[13],這與本研究發現0.5 μmol/L褪黑素可逆轉水溶性膽固醇誘導的VSMC增殖的結果一致。另有研究表明,在膽囊癌中褪黑素通過抑制細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路,可抑制癌細胞遷移和侵襲[14],然而本研究中并未發現褪黑素有抑制VSMC遷移的作用,這種差異的具體原因還不清楚,可能是由于細胞系不同造成。

綜上所述,本研究結果表明褪黑素可抑制VSMC巨噬樣表型轉化。