TRPV4抑制劑HC067047對小鼠膝骨關節炎軟骨組織的影響

劉德龍, 楊瞻宇, 陳昕彤, 王奕威, 關蕊, 盛斌

湖南師范大學附屬第一醫院骨科,湖南長沙 410000

膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)主要表現為膝關節疼痛和活動受限,其主要病理性改變為軟骨細胞、細胞外基質以及軟骨下骨的合成和降解偶聯失衡[1]。瞬時受體電位香草素受體4型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)是一種多模式的鈣滲透性陽離子通道,能被多種細胞外刺激所激活,進而調控鈣離子內流,從而引發生物學效應[2]。研究發現,TRPV4既可在軟骨細胞膜上參與低滲透壓引起的炎性反應,又可在軟骨細胞中引起鈣離子內流導致軟骨破壞[3]。因此,抑制TRPV4的表達可能對KOA的軟骨組織發揮保護作用。研究發現,細胞焦亡可能參與了KOA疾病的發生發展[4-5]。本研究通過體內實驗探討TRPV4抑制劑HC067047對小鼠膝骨關節炎軟骨組織的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

10周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠30只,體質量20～25 g,由湖南斯萊克景達動物有限公司提供,合格證號:SCXK(湘)2019-0018。白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18 ELISA試劑盒購于武漢Elabscience生物技術有限公司;GSDMD抗體、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)抗體、Caspase-1抗體、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族熱蛋白結構域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)抗體、IL-1β和IL-18抗體購于美國Santa Cruz公司;TRPV4抗體、HE染液購于美國Sigma公司;生物素化兔抗羊抗體購于北京康為試劑生物科技有限公司;HC067047購于美國TargetMol公司;ABC試劑盒購于北京Biolead生物科技有限公司;DAB顯色試劑盒購于北京Zsbio生物技術有限公司;酶聯免疫吸附法檢測試劑盒、番紅固綠染色液購于廣州勞斯生物科技有限公司。

1.2 動物分組及模型建立

將30只小鼠均分為假手術組、模型組、HC067047組。假手術組僅切開右側膝關節髕韌帶內側皮膚,不予處理膝關節囊內結構。模型組、HC067047組手術切除小鼠板股韌帶及內側半月板前角以構建膝骨關節炎模型,HC067047組每天10 mg/kg HC067047灌胃6周[6],假手術組、模型組等量生理鹽水灌胃6周。所有小鼠在18～22 ℃、相對濕度50%～65%環境中飼養,活動、飲食、飲水自由。

1.3 番紅固綠染色及軟骨下骨骨量檢測

膝關節軟骨組織固定,切成石蠟切片,脫蠟,浸入番紅O染色液染色,然后酸性乙醇分化液分化15 s,用35%、50%、70%、80%乙醇脫色,隨后水洗1 min,再入固綠染色液內浸染,然后蒸餾水下沖洗1 min,無水乙醇脫水3～5 min,50%二甲苯+50%乙醇透明5 min,二甲苯5 min,最后用樹脂封固,每張切片選取5個不同視野。采用國際骨關節炎研究學會(international association for the study of osteowrthritis,OARSI)評分[7]評定軟骨及軟骨下骨骨量,總分20分,評分越高表示病情越嚴重。

1.4 HE染色檢測

取膝關節軟骨組織的石蠟切片,二甲苯脫蠟,經乙醇逐步脫水,二甲苯5 min×2,100%乙醇2 min,95%乙醇1 min,80%乙醇1 min,75%乙醇1 min,蒸餾水洗2 min,蘇木精染色5 min,自來水沖洗,鹽酸乙醇分化30 s,自來水浸泡15 min,置伊紅液2～3 min,常規脫水,透明,封片,95%乙醇30 s,100%乙醇30 s×2,100%乙醇1 min×2,二甲苯15 min,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察軟骨下骨變化情況。

1.5 qRT-PCR檢測TRPV4 mRNA表達水平

假手術組、模型組膝關節軟骨組織磨碎勻漿提取總RNA,然后加入反轉錄反應體系,反應條件:95 ℃變性15 min、94 ℃變性30 s、37 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,28～36個循環,4 ℃保存反轉錄產物。TRPV4引物序列:正向為5′-ACCTTCTGCACCAACCTCCT-3′,反向為5′-AGCCCGTAGAGCATGAATTG-3′;GAPDH引物序列:正向為5′-ACAGCTTFTGGGTGGGTCCACGAC-3′,反向為5′-TTTGAGGGACGTCCGAACTT-3′。采用2-ΔΔCt計算法分析實驗數據。

1.6 免疫印跡檢測TRPV4和焦亡相關蛋白水平

取膝關節軟骨組織磨碎勻漿,加入裂解液充分振蕩搖勻并放置冰上充分裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,取組織上清,參照BCA蛋白定量試劑盒要求測定其中總蛋白含量,90 V、90 min電泳后轉移至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入TRPV4(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、ASC(1∶1 000)、GSDMD(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、IL-18(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、β-tubulin(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液洗滌3次,每次10 min,室溫下加二抗(1∶5 000)孵育2 h。采用凝膠成像儀顯影。

1.7 ELISA檢測

將100 μL各組血清加入標準孔和樣品孔中,置于37 ℃溫育箱中90 min,甩干孔中液體后加入100 μL抗體工作液置于37 ℃溫育箱中1 h,甩干液體后加225 μL洗滌液,靜置1 min甩干板內液體,加100 μL酶結合物,置于37 ℃溫育箱30 min;棄去孔內液體洗板5次,在每孔中加90 μL底物溶液,置于37 ℃避光孵育15 min,加終止液50 μL,測量各孔在450 nm波長的光密度值。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 TRPV4對KOA小鼠關節軟骨及軟骨下骨骨量的影響

番紅固綠染色結果顯示,假手術組膝關節軟骨與軟骨下骨界限清楚,潮線清晰,骨小梁排列正常,番紅染色范圍大、顏色深,軟骨表面光滑。模型組軟骨表面膜樣結構破壞,軟骨層明顯變薄,潮線不完整,骨小梁排列紊亂,番紅染色范圍減小、顏色較淺,OARSI評分較假手術組升高(P<0.05)。與模型組比較,HC067047組減緩軟骨破壞進程,軟骨層變薄改善,潮線完整,骨小梁排列輕微紊亂,番紅染色范圍增加、顏色較深,OARSI評分降低(P<0.05)。HE染色結果發現,與假手術組比較,模型組膝關節軟骨下骨骨量顯著增高(P<0.001),給予HC067047干預后,膝關節軟骨下骨骨量顯著降低(P<0.05;圖1)。

圖1 TRPV4對膝骨關節炎小鼠關節軟骨及軟骨下骨骨量的影響A為番紅固綠染色(4×)和HE染色結果(20×);B為OARSI評分;C為軟骨下骨骨量。a為P<0.05,與假手術組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.2 KOA小鼠軟骨組織中TRPV4的表達水平

與假手術組比較,模型組小鼠膝關節軟骨組織中TRPV4 mRNA及其蛋白表達水平明顯增加(P<0.05;圖2)。

圖2 膝骨關節炎小鼠軟骨組織中TRPV4的表達水平A為RT-PCR檢測TRPV4 mRNA;B為Western blotting檢測TRPV4蛋白。a為P<0.05,與假手術組比較。

2.3 TRPV4對KOA小鼠關節軟骨組織中焦亡相關蛋白表達水平的影響

與假手術組比較,模型組膝關節軟骨組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,HC067047組NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達水平顯著降低(P<0.05;圖3)。

圖3 TRPV4對KOA小鼠關節軟骨細胞焦亡相關蛋白表達水平的影響A為Western blotting;B為柱狀圖。a為P<0.05,與假手術組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

2.4 TRPV4對KOA小鼠血清和關節軟骨組織中炎癥因子表達水平的影響

與假手術組比較,模型組小鼠血清及關節軟骨組織中IL-1β、IL-18水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,HC067047組小鼠血清及關節軟骨組織中IL-1β、IL-18水平顯著降低(P<0.05;圖4)。

圖4 TRPV4對KOA小鼠血清和關節軟骨組織中炎癥因子表達水平的影響A為ELISA檢測小鼠血清炎癥因子的水平;B為軟骨組織炎癥因子蛋白相對表達水平;C為軟骨組織炎癥因子相對灰度值。a為P<0.05,與假手術組比較;b為P<0.05,與模型組比較。

3 討 論

膝骨關節炎是一種發病以逐年年輕化且不可逆的慢性變性關節炎疾病,以軟骨、半月板、韌帶退化,滑膜炎癥,軟骨下骨改變為特征[8-9]。盡管多種因素如衰老、創傷、炎癥等一系列因素都能影響KOA的發生發展[10],但是,目前對KOA的病理機制仍知之甚少。研究表明,炎癥在促進骨關節炎發展過程中扮演重要角色,因此抗炎治療可有效延緩KOA的發病[11],然而目前長期服用非甾體類抗炎藥會引起高血壓、充血性心力衰竭和腎毒性等不良反應[12-13],因此尋找新的KOA抗炎靶點至關重要。

TRPV4在多種細胞類型中表達,可被多種內源性物質、炎癥等多種刺激激活。研究發現,TRPV4受體在銀肩病關節炎和類風濕性關節炎的發病中表達上調[14-15],而TRPV4的缺失可能促進骨關節炎的惡化[16]。Walter等[17]發現,在退變的椎間盤組織中TRPV4表達增多,參與椎間盤的退變過程。而姚旺祥等[18]研究證實,關節軟骨組織中TRPV4的陽性細胞率與骨關節炎嚴重程度呈正相關。本研究結果顯示,與假手術組小鼠比較,KOA小鼠的膝關節軟骨組織中TRPV4 mRNA及其蛋白表達水平顯著增加,表明抑制軟骨組織中TRPV4的表達可能延緩KOA的發展;與模型組比較,HC067047處理組小鼠膝關節中的軟骨層變厚,潮線完整,骨小梁排列紊亂減輕,OARSI評分降低,提示抑制TRPV4的表達水平能夠改善骨關節炎小鼠的膝關節軟骨退變,但TRPV4影響軟骨退變的機制目前尚不十分清楚。

細胞焦亡是一種伴有炎癥反應的程序性細胞死亡,可由多種病理刺激引起,如氧化應激、高血糖、炎癥等[19-21],主要包括由Caspase-1的介導經典途徑和由Caspase-4、5、11介導的非經典途徑[22]。細胞內的炎癥小體有NLRP3、AIM2和pyrin等[23],當細胞內的NLRP3被刺激因子激活,激活后NLRP通過ASC蛋白連接Caspase-1前體即pro-Caspase-1,pro-Caspase-1被活化后能夠發生自我剪切,形成Caspase-1[24]。研究發現,Caspase-1的活化一方面能夠促進促炎因子的成熟,另一方面也能切割GSDMD蛋白使其生成GSDMD-N片段,GSDMD-N片段能夠轉移至細胞膜,造成細胞膜穿孔,導致細胞內促炎因子如IL-1β、IL-18的大量釋放,進而使細胞發生腫脹形成焦亡[25-26]。研究證實,IL-1β是骨關節炎滑膜炎癥的重要誘導因子,能促進軟骨破壞,而IL-18促進軟骨細胞外基質降解方面發揮重要作用[27-28]。本研究結果顯示,HC067147能顯著抑制KOA小鼠軟骨組織中NLRP3、Caspase-1、AIM2和GSDMD-N的表達,降低KOA小鼠血清和軟骨組織中IL-1β、IL-18的水平,提示TRPV4抑制劑HC067047在KOA小鼠的軟骨組織中能夠抑制細胞焦亡。TRPV4可能通過促進細胞焦亡影響小鼠骨關節炎軟骨退化,但細胞焦亡的發生在此過程中也可能是伴隨發生的,因此后續實驗需要通過特異性敲除TRPV4證實其與細胞焦亡在骨關節炎小鼠軟骨組織中的直接關系。

綜上,TRPV4可能通過抑制細胞焦亡促進骨關節炎小鼠軟骨退變,TRPV4抑制劑HC067047有望成為骨關節炎的治療靶點。