長鏈非編碼RNA SOX9-AS1在原發性肝細胞癌中的診斷價值

黃穎, 黃楠, 宋菊, 季沈杰, 王欽君

啟東市人民醫院 啟東肝癌防治研究所 南通大學附屬啟東醫院檢驗科,江蘇啟東 226200

原發性肝癌是來源于肝細胞或肝內膽管上皮細胞的惡性腫瘤,以原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最為常見,死亡率位居第三位[1],5年生存率僅為10%[2],因此HCC的早期診斷尤為重要。目前臨床上常用篩查指標是甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP),其靈敏度和特異度均不高,在某些良性肝臟疾病如肝硬化(liver cirrhosis,LC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)中亦可出現AFP不同程度升高[3-4]。因此,需要尋找靈敏度、特異度更高的新肝癌標志物。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)參與多種腫瘤的發生和發展[5-7],可通過調控多個通路的關鍵基因表達影響肝癌細胞增殖、遷移、侵襲,從而促進肝癌發展和轉移[8]。有研究發現,SOX9-AS1在肝癌組織中高表達,且與HCC患者預后不良密切相關[9],但目前尚未有研究探索血清SOX9-AS1在肝癌患者中的診斷價值,本研究對此進行了探討,評價其作為肝癌診斷標志物的臨床價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集本院2019年12月—2022年1月就診肝病患者180例,其中HCC組70例,男性49例,女性21例;LC組55例,男性24例,女性31例;CHB組55例,男性31例,女性24例。HCC、LC患者經實驗室、影像學及病理學檢查明確診斷,CHB患者納入標準為HBsAg陽性>6個月且排除肝癌、肝硬化、其他器官腫瘤等重大疾病。健康對照組(healthy controls,HC)為同期體檢健康者50例,男性35例,女性15例。所有受試者均簽署知情同意書,本研究經本院醫學倫理學委員會批準(ER-XJS-LWTG-2020018)。收集各組一般資料和實驗室常規檢測項目,包括總膽紅素(total bilirubin,TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)、谷丙轉氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)、谷草轉氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)和AFP。

1.2 qRT-PCR檢測血清SOX9-AS1

利用血清總RNA提取試劑盒(北京BioTeke公司)提取血清總RNA。按反轉錄試劑盒(美國Theromo)說明書配置反應體系,選擇CFX96 Deep Well基因擴增儀做反轉錄(美國Bio-Rad),反應條件:42 ℃ 60 min,72 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。cDNA產物于-80 ℃冰箱保存備用。引物序列SOX9-AS1正向:5′-ACGTCAGCGAGCTTGAGAAA-3′,反向:5′-GACATACGTCGGGAGCTCAG-3′;內參GAPDH正向:5′-GACATACGTCGGGAGCTCAG-3′,反向:5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′(上海生工)。PCR反應體系:SYBR GreenⅠmix 10 μL、cDNA 3 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、RNase-free water 5 μL,共20 μL。PCR反應條件:95 ℃ 10 min,1個循環;95 ℃ 15 s、、56 ℃30 s、72 ℃30 s,共45個循環。采用2-ΔΔCt法計算靶基因SOX9-AS1相對表達水平,計算公式ΔΔCt=實驗組(CtSOX9-AS1-CtGAPDH)-對照組(CtSOX9-AS1-CtGAPDH)。

1.3 方法學評價

由于目前市場上沒有SOX9-AS1標準品售賣,因此以50名健康體檢者混合血清為標準品進行檢測。將混合血清以1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋,繪制標準曲線,根據E=10-1/slope-1計算擴增效率,評價檢測方法的線性。將混合血清同一批次進行10次平行孔檢測SOX9-AS1水平,計算批內變異系數;將混合血清分成10等份,每天提取1份檢測,計算批間變異系數,以此評價檢測方法的精密度。將混合血清在室溫下放置0、6、12、18、24 h以及反復凍融0、2、4、6、8次后提取并檢測,以此評價血清SOX9-AS1穩定性。采用建立的qRT-PCR法雙復孔檢測所有血清樣本。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7軟件進行數據分析。計數資料以例(%)表示,計量資料以中位數(四分位數)表示,采用Kruskal-Wallis檢驗。采用ROC評價SOX9-AS1、AFP對HCC的診斷效能。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組一般資料和實驗室指標的比較

HCC組、LC組、CHB組和HC組之間比較,年齡、TBIL、ALB、GPT、GOT的差異均有統計學意義(P<0.05;表1)。HCC組、LC組、CHB組及HC組血清AFP水平依次降低,HCC組AFP水平最高(P<0.05;表1)。

表1 各組一般資料和實驗室指標的比較

2.2 SOX9-AS1線性、精密度和穩定性

SOX9-AS1標準曲線為Y=-3.441X+26.27,R2=0.9978,擴增效率為0.952 5(圖1)。SOX9-AS1批內變異系數為2.82%,SOX9-AS1批間變異系數為1.19%?；旌涎逶谑覝叵路胖?、6、12、18、24 h以及反復凍融0、2、4、6、8次后檢測SOX9-AS1表達水平均無明顯差異(P>0.05,圖1),提示SOX9-AS1穩定性良好。

2.3 各組血清SOX9-AS1的比較

HCC組、LC組、CHB組及HC組血清SOX9-AS1依次降低,HCC組SOX9-AS1水平最高(P<0.05;圖2)。

圖2 各組血清SOX9-AS1的比較

2.4 血清SOX9-AS1、AFP對HCC的診斷效能

SOX9-AS1聯合AFP對HCC的診斷效能最高(P<0.05;表2和圖3)。

圖3 血清SOX9-AS1、AFP單獨或聯合診斷的ROC曲線

表2 血清SOX9-AS1、AFP對HCC的診斷效能

3 討 論

研究證明,lncRNA可作為腫瘤輔助診斷和預后判斷的標志物[5-9]。Han等[10]發現,SCARNA10在HCC患者血清中的表達水平明顯高于LC和CHB患者,其診斷效能優于傳統的AFP。LncRNA CRNDE在HCC患者血清中高表達,其表達水平與腫瘤大小、分化程度和TNM分期有關,lncRNA CRNDE高表達患者的總體生存率和無病生存率明顯低于低表達患者,Cox回歸分析提示lncRNA CRNDE可作為HCC的獨立預后因素[11]。除此之外,HULC、MALAT1、UCA1等循環腫瘤lncRNA也被證實對HCC的輔助診斷有一定的價值[12-14]。

SOX9-AS1是lncRNA SOX9的反義鏈,在HCC腫瘤組織和細胞中高表達,與miR-5590-3p和SOX9形成SOX9-AS1/miR-5590-3p/SOX9正反饋回路,調控Wnt/β-catenin通路,促進HCC生長和轉移[9]。為了探討SOX9-AS1對HCC的診斷價值,本研究采用qRT-PCR檢測血清SOX9-AS1,繪制SOX9-AS1標準曲線,線性回歸系數R2為0.997 8,說明方法線性良好;計算SOX9-AS1擴增效率為0.952 5,符合qPCR進行定量分析的擴增效率范圍要求;批內變異系數為2.82%,批間變異系數為1.19%,符合臨床檢驗定量檢測項目精密度要求;混合血清在室溫放置一定時間或反復凍融后檢測結果無明顯變化,說明血清穩定性良好。

本研究發現,HCC組、LC組、CHB組及HC組血清SOX9-AS1依次降低,提示SOX9-AS1不僅能區分HCC患者與健康對照者,還能有效區分LC患者與CHB患者。目前臨床上用來診斷HCC的血清學標志物AFP特異性不高,在本研究中納入的55例LC患者和55例CHB患者血清中也能觀察到AFP不同程度升高。ROC曲線分析顯示,SOX9-AS1對HCC具有一定的診斷價值,將SOX9-AS1與AFP聯合檢測,診斷效能優于兩者單項檢測。

綜上所述,SOX9-AS1升高可用于區分肝癌患者與健康對照者,可用于監測肝臟疾病的進展。SOX9-AS1與AFP聯合檢測能有效提高診斷效能,血清SOX9-AS1有望成為新的肝癌診斷標志物。但本研究缺乏隨訪數據,無法進行生存分析,SOX9-AS1與肝癌預后的關系仍需進一步探索。