艾絨的HPLC 指紋圖譜及主要成分含量測定

★ 姚閩 袁銘銘 吳西 雷景邦 白吉慶（.江西省藥品檢驗檢測研究院/國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室/江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心 南昌 009；.江西省藥品監督管理局 南昌 009；.陜西中醫藥大學 陜西 咸陽 7046）

艾葉為菊科蒿屬植物艾Artemisia argyiLevl. et Vant.的干燥葉，可溫經止血，散寒止痛［1］。艾葉主要含有黃酮、揮發油、有機酸、三萜等成分［2-5］。艾葉具有止血、解熱鎮靜、平喘鎮咳、祛痰、抗凝血、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用［4-6］。艾絨是由艾葉料剔除塵土粗梗、粉碎后，過篩除葉肉、葉脈和葉梗等粉末得到篩上層艾絨［7］。目前市場上出售的艾絨，多約定俗成采用葉絨比作為艾絨質量評判的一個要素，市面上的艾絨多數標以比例2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、30∶1，如葉絨比2∶1 表示將2 kg 艾葉制備得到1 kg 的艾絨，即艾絨在加工過程中篩掉的雜質越多，得到的艾絨量越低，艾絨的純度就越高，質量越好。目前，主要對其揮發性成分、粉碎度、燃燒值以及氮元素進行研究［8-12］，而對其非揮發性成分黃酮類和酚酸類成分未進行研究?；诖?，通過HPLC 構建艾絨的指紋圖譜，并對23 批不同艾絨樣品中7 個指標成分（黃酮類和酚酸類）進行含量測定，為艾絨的等級評價和質量控制提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

Agilent 1260 型HPLC 儀，ME204TE 型XSE-205 型電子天平，HH-6 型六孔數顯恒溫水浴鍋，DFY-1000C 高速搖擺式粉碎機。

1.2 主要藥品與試劑

隱綠原酸（批號CFN99117，純度99.0%）、異綠原酸B（批號CFN99119，純度99.2%）、異綠原酸A（批號CFN99118，純度99.5%）、異綠原酸C（批號CFN99120，純度98.5%）、宗矢車菊素（批號CFN90386，純度99.5%）、異澤蘭黃素（批號CFN99117，純度99.2%）均購于上海洽姆儀器科技有限公司；綠原酸（批號110753-202018，純度96.1%）購于中國食品藥品檢定研究院。

本研究所有樣品均由江西省藥品檢驗檢測研究院萬林春鑒定為植物艾的干燥葉。參考艾絨制備工藝流程，采用DFY-1000C 高速搖擺式粉碎機將各批次艾葉粉碎，將粉碎的艾葉過篩，過篩后剩余艾絨制成不同葉絨比的艾絨飲片，具體艾絨信息見表1。

表1 23批不同葉絨比等級的艾絨信息

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品的制備 精密稱取艾絨0.5 g，置于具塞錐形瓶，加入50 mL 80%甲醇，首次稱重，采用加熱回流法回流1 h，放冷，再次稱重，采用80%甲醇補重，搖勻，過濾。

2.1.2 混合對照品的制備 精密稱取綠原酸、異綠原酸A、隱綠原酸、異澤蘭黃素、異綠原酸B、宗矢車菊素、異綠原酸C 7 個成分對照品，加80%甲醇制成含綠原酸對照品濃度為0.022 2 mg/mL、異綠原酸A 對照品濃度為0.008 3 mg/mL、隱綠原酸對照品濃度為0.014 6 mg/mL、異澤蘭黃素對照品濃度為0.035 6 mg/mL、異綠原酸B 對照品濃度為0.034 7 mg/mL、宗矢車菊素對照品濃度為0.008 0 mg/mL 和異綠原酸C 對照品濃度為0.020 4 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.3 空白溶液 以80%甲醇溶液作為空白溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18MG Ⅱ S5（4.6 mm×250 mm, 5 μm），洗脫溶液：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），條件（0～12 min，13%A；12～15 min，13%→21%A；15～40 min，21%A；40～60 min，21%→70%A）；柱溫：30℃；檢測波長：330 nm；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。

2.3 專屬性考察

精密吸取按“2.1”項下所制備的空白、供試品、混合對照品等溶液，并采用“2.2”項下色譜方法進行檢測。各成分的分離度良好（理論塔板數按綠原酸色譜峰計不低于5 000），空白溶液對待測成分均無干擾，表明專屬性較好。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 方法學考察 精密稱取艾絨樣品（編號AR-1）0.5 g，按“2.1.1”項下制備供試品，采用“2.2”項下色譜方法，連續進樣6次，以異綠原酸C（9號峰）為參照峰，測得12 個共有峰的相對峰面積、相對保留時間的RSD均小于2.0%（n=6），表明精密度較好。取同一艾絨樣品（編號AR-1）的供試品溶液，在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，按照“2.2”項下色譜方法測定，12 個峰與上述指標的RSD均小于2.0%（n=6），表明在室溫下，該樣品放置24 h 內穩定。稱取同一艾絨樣品（編號AR-1）6 份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.1.1”項下制備供試品，利用“2.2”項下色譜方法測定，RSD均小于2.0%（n=6），表明該方法的重復性較好。

2.4.2 HPLC 指紋圖譜的構建和相似度評價 從23 批艾絨中分別稱取0.5 g，按“2.1.1”項下供試品溶液方法制備，采用“2.2”項下色譜方法檢測。將23 批艾絨圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 年版），以S12圖譜為參照，采用中位數法自動匹配，生成并對照指紋圖譜，進行相似度評價。同時，確認對照指紋圖譜色譜峰，確定12 個共有峰，并以9 號色譜峰（異綠原酸C）作為參照峰，比對對照品的保留時間和色譜峰，指認了其中7 個共有峰，為綠原酸（2 號峰）、隱綠原酸（3 號峰）、異綠原酸B（6 號峰）、異綠原酸A（8 號峰）、異綠原酸C（9 號峰）、宗矢車菊素（11 號峰）和異澤蘭黃素（12 號峰）。各圖譜與對照圖譜相似度為0.885～0.998，可見23 批艾絨具有較高相似度。23 批艾絨對照與疊加指紋圖譜、相似度評價見圖2、表2。

圖2 23批艾絨的對照與疊加指紋圖譜

表2 23批艾絨指紋圖譜的相似度評價

2.5 7 個成分的含量測定

2.5.1 線性范圍考察 取混合對照品溶液1、2、5、10、20、30 μL，采用“2.2”項下色譜方法進行檢測，以7 個成分的進樣量為橫坐標（X），成分的峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，各成分具有較好的線性關系。見表3。

表3 艾絨中7個成分方法學考察參數

2.5.2 精密度試驗 精密稱取艾絨樣品（編號AR-1）0.5 g，按 “2.1.1”項下供試品溶液的方法制備，采用“2.2”項下色譜方法檢測，連續進樣6 次。結果7 種成分峰面積的RSD（n=6）分別為0.33%、0.42%、0.17%、0.51%、0.36%、0.62%、0.25%，說明檢測儀器的精密度較好。

2.5.3 重復性試驗 稱取同一艾絨樣品（編號AR-1）6 份，每份0.5 g，分別按“2.1.1”項下供試品溶液的制備方法，然后按照“2.2”項下色譜方法測定，記錄7 個成分的峰面積，并計算含量（外標法）。結果7 種成分峰面積的RSD（n=6）分別為0.52%、1.03%、0.42%、0.37%、0. 28%、0.72%、0.41%，均小于2%，表明該方法的重復性較好。

2.5.4 穩定性試驗 取同一艾絨樣品（編號AR-1），按“2.1.1”項下供試品溶液的制備方法，制備后在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，采用“2.2”項下色譜方法檢測。7 個成分峰面積的RSD（n=6）分別為0.62%、0.89%、0.43%、0.37%、0. 29%、0.74%、0.46%，均小于2%，表明該艾絨樣品在室溫下24 h之內較穩定。

2.5.5 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知含量的艾絨樣品（編號AR-1）0.25 g，各6 份，按已知量的100%分別加入相對應的混合對照品溶液含綠原酸（0.011 1 mg/mL）、隱綠原酸（0.004 2 mg/mL）、異綠原酸B（0.007 3 mg/mL）、異綠原酸A（0.017 8 mg/mL）、異綠原酸C（0.017 4 mg/mL）、宗矢車菊素（0.004 mg/mL）、異澤蘭黃素（0.010 2 mg/mL）50 mL，按 “2.1.1”項下供試品溶液的方法制備，采用“2.2”項下色譜方法檢測，計算加樣回收率。見表4。

表4 艾絨中綠原酸等7個成分加樣回收率試驗結果（n=6）

2.5.6 艾絨樣品中7 個主要黃酮類和酚酸類成分的含量測定 取23 批艾絨樣品，按“2.1.1”項下供試品溶液的制備方法，采用“2.2”項下色譜方法檢測，計算艾絨樣品中7 個成分的含量（外標法）。見表5。

表5 艾絨中7個成分的含量測定（n=3） mg/g

3 討論

3.1 樣品提取方法的優化

采用30%、50%、80%、100%甲醇以及乙醇、水提取艾絨，發現采用80%甲醇提取時，各個色譜峰的分離度較好，化合物信息量最多。因此，選擇80%甲醇提取艾絨樣品。分別考察超聲提取和回流提取，發現兩者色譜峰峰面積有較大差別，超聲提取法的峰面積明顯小于回流提取法，7 個主成分的含量更高，故本研究選擇回流提取法提取艾絨樣品?？疾焯崛悠窌r間（30、60、90 min）、料液比（1∶50、1∶100、1∶200 g/mL）對色譜峰影響，研究選擇60 min，1∶100 g/mL 提取。

3.2 色譜條件的優化

考察3 種流動相體系（乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水），采用乙腈-0.1%磷酸溶液洗脫分離度較好，化合物信息量更大。同時，DAD檢測器掃描在200～400 nm 范圍內，發現12 個共有峰均在330 nm 附近有較大吸收，且各待測成分與其他成分的色譜峰分離較好，因此以330 nm 為檢測波長。

3.3 指紋圖譜分析及主成分含量測定結果分析

指紋圖譜作為整體、穩定的化學鑒別手段，在中藥材和中成藥的質量控制中具有非常重要的作用，為此構建23 批艾絨樣品的HPLC 指紋圖譜，共確認12 個共有峰，并進行相似度評價。結果本研究共指認7 個成分，23 批樣品的相似度均大于0.885，表明不同葉絨比的艾絨具有較高相似度，但是葉絨比增大，相似度減少。為進一步考察艾絨的質量，并建立相應的含量測定方法，并對23 批次不同艾絨進行了測定，雖然指紋圖譜的相似均較高，但不同批次的各成分的含量差異較明顯，同時指紋圖譜相似度和各成分含量測定結果顯示，葉絨比越大，相似度和含量越低，這可能與艾絨在加工制備時需要不斷地過篩，篩除掉艾粉和艾渣，艾粉主要為艾葉的葉肉組織，其內含有大量的有機成分。因此，葉絨比越大的艾絨，所含的雜質和艾粉越少，其相似度和各成分含量就越低。

綜上，本研究建立的方法，簡便、準確、可靠，且艾絨指紋圖譜和主要成分含量測定可為艾絨等級的鑒定提供新的參考依據。