基于數據挖掘的重癥肌無力動物模型應用分析

★ 徐添 官磊瑤 劉浪輝 王瑞奇 吳國艷 黃梅 黃春華（.江西中醫藥大學 南昌 330004；.江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG） 是一種主要由乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR）抗體介導，補體及多種因素參與的自身免疫性疾?。?］，病變主要累及神經肌肉接頭突觸后膜上的乙酰膽堿受體［2］。其全球患病率及病死率逐年升高，死亡原因包括呼吸衰竭和肺部感染，嚴重危害患者生命健康和生活質量［3］。目前MG 的治療以膽堿酯酶抑制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、血漿置換以及胸腺切除為主［4-6］，這些方法雖然能緩解MG 癥狀，但長期使用可引起一系列不良反應［7］。因此，現代醫學越來越關注與MG有關的動物實驗研究，穩定可靠的動物模型是開展實驗研究的基礎和關鍵。本研究基于數據挖掘，通過檢索MG 相關動物實驗研究文獻，對現有的造模要素進行歸納分析，以期為MG 實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源

以重癥肌無力和動物模型為主題，檢索CNKI、萬方、維普、Sinomed、Pubmed 數據庫，中文數據庫檢索時間為2001 年至今（共檢索出相關文獻490 篇）、外文數據庫檢索時間為2011 年—2021 年（共檢索出相關文獻243 篇）。

1.2 納入與排除標準

選擇MG 模型期刊文獻，排除綜述類、碩博論文、會議類及MG 體外實驗文獻等，共有137 篇文獻符合標準。

1.3 統計學方法

將實驗動物選擇、造模方法、陽性藥、檢測指標等按照《實驗動物和動物實驗技術》［8］進行規范，并錄入Excel 2019，采用頻數分析進行統計歸納。

2 結果

2.1 MG 模型實驗動物選擇

將納入的137 篇文獻中所涉及的實驗動物種類、性別、年齡及體重進行統計分析（部分文獻未標注），MG 模型實驗中動物：Lewis 大鼠，雌性，6～8 周齡，體重140～180 g；C57BL/6 小鼠，雌性，6～8 周齡，體重14～16 g；SD 大鼠，雄性，8～10 周齡，體重200～250 g。見表1。

表1 MG動物模型實驗常用動物統計

2.2 MG 模型實驗動物種類分布情況

將納入的137 篇文獻中的全部實驗動物種類進行分類排序，共有13 類動物，累積頻次137 次，其中2 篇文獻中的動物未標種類，故在此不做統計。從分析結果可以看出MG 模型所用動物種類中，使用最多的為Lewis 大鼠（67 次，48.91%），其次為C57BL/6 小鼠（51 次，37.23%），SD 大鼠（5 次，3.65%），其他種類動物14 次。見圖1。

圖1 MG模型實驗動物種類分布

2.3 MG 模型實驗動物性別分布情況

將納入的137 篇文獻中所涉及的實驗動物性別進行分類，共139 次，13 次未對動物性別做出標注，剩下的126 次中，雌性（107 次，84.92%），雄性（16 次，12.70%），雌雄各半（3 次，2.38%）。見圖2。

圖2 MG模型實驗動物性別分布

2.4 MG 模型造模方法

在重癥肌無力研究中，常用的動物模型主要有5 種［9-10］：（1）AChR 誘導的實驗性自身免疫性重癥肌無力（EAMG）模型，主要是電鰩AChR 誘導的EAMG 模型［11］和人工合成肽段誘導的EAMG模型［12］。（2）利用雜交瘤細胞株制備單克隆抗體建立被動轉移模型；被動轉移MG 患者或慢性EAMG 動物血清中的AChR-Ab；通過向實驗動物腦室中注入MG 患者AChR-Ab 建立被動轉移模型；被動轉移AChRa 亞基單克隆抗體。（3）通過MG患者胸腺組織移植建立被動轉移模型。（4）MuSK誘導的MG 模型［13］。（5）LRP4 誘導的MG 模型［14］。通過分析納入的137 篇文獻，其中電鰩AChR 誘導的EAMG 模型使用頻次最高（57 次，41.61%），其次為人工合成肽段誘導EAMG 模型（41 次，29.93%）。見表2。

表2 MG動物模型分類

2.5 MG 模型陽性藥

統計顯示，MG 實驗研究中陽性藥的選擇主要為強的松［15-16］，其次為溴吡斯的明［17-18］。

2.6 MG 造模成功標準

MG 造模成功標準主要通過以下幾個方面進行評估：（1）臨床表現變化，動物體重及肌力，精神狀態、毛色、步態、日?；顒?、咀嚼攝食情況、呼吸頻率等［19］；（2）行為學指標，游泳試驗、抓握試驗、懸吊試驗等；（3）新斯的明試驗；（4）AChR 抗體濃度及滴度檢測；（5）電生理改變，低頻重復電刺激的衰減率（RNS）、肌電圖等；（6）病理形態學觀察，骨骼肌神經肌肉接頭處病理改變。

2.7 MG 模型相關檢測指標

將納入的137 篇文獻中的全部檢測指標進行分類排序，共涵蓋16 種不同的指標類型，累積頻數374 次。其中檢測較多的指標為ELISA 法檢測血清中的生化指標（94 次，25.13%），流式細胞儀分析脾臟和淋巴結、外周血、骨髓等組織細胞（57 次，15.24%），RT-PCR 檢測相關基因包括脾臟和淋巴結、肌肉、胸腺等組織淋巴細胞總RNA及mRNA 的表達等（43 次，11.50%），Western Blotting 法檢測相關蛋白包括脾臟和淋巴結、肌肉、胸腺等組織蛋白檢測（26 次，6.95%），免疫熒光技術包括NMJ 處電生理、形態學和生物化學（26 次，6.95%）等。見表3。

表3 檢測指標分類

94 篇ELISA 法檢測血清中的生化指標累積頻數132 次，其中較多的血清生化指標為AChR抗體水平（58 次，43.94%），細胞因子水平包括TGF-β、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10 和IL-17 等（24 次，18.18%），AChR IgG 抗體亞類包括IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗體（22 次，16.67%）等。見表4。

表4 ELISA 法檢測血清中的生化指標分類

3 討論

MG 主要表現為波動性無力和易疲勞性，晨輕暮重，活動后加重，休息后可減輕。全身骨骼肌均可受累，眼外肌最易受累，表現為對稱或非對稱性上瞼下垂和復視，是MG 最常見的首發癥狀，見于80%以上的MG 患者［4,20］，其他還可導致面肌、咀嚼肌、頸肌，呼吸機等受累。發病早期可單獨出現眼外肌、喉肌或肢體肌肉無力的癥狀，逐漸累及其他肌群，直到全身肌無力。部分患者短期內病情迅速進展，發生肌無力危象，危及生命［21］。MG 當屬中醫學“痿證”“痿躄”“瞼廢”“虛損”等范疇，《素問·痿論》曰：“五臟使人痿，何也？岐伯對曰：肺主身之皮毛，心主身之血脈，肝主身之筋膜，脾主身之肌肉，腎主身之骨髓，故肺熱葉焦，則皮毛虛弱急薄，著發為痿躄也?！敝赋霰静〉闹饕C是肺熱葉焦，將痿證分為皮、脈、筋、骨、肉五痿，并提出“治痿獨取陽明”的基本原則［21］，其治療核心為補脾益氣［16,23］。

目前治療該病尚無特效藥物，現有藥物的長期使用常伴隨一系列不良反應。隨著MG 的發病率和死亡率逐年升高，人們對其關注也與日俱增，尋找一種更為安全有效的治療藥物或方案尤為重要。本文通過分析MG 相關動物實驗研究發現，MG 模型常用動物為大鼠和小鼠，研究表明鼠的行為改變與人發病的表現最為相似，且已有相對成熟的技術對鼠進行轉基因和基因敲除等處理，同時鼠較其他大型動物所需的免疫劑量更少，在造價、繁殖、操作等方面更具優勢。MG 實驗研究常選用Lewis 大鼠和C57BL/6 小鼠，Lewis 大鼠與人MG 表現最相像，且進展快、癥狀嚴重［9,25］；C57BL/6 小鼠對實驗性自身免疫性重癥肌無力的易感性較高，發病率在50%～70%［26-27］，其中大鼠較小鼠更易出現額外的急性反應期及更嚴重的肌無力癥狀。統計顯示，在動物性別的選擇上雌性較雄性更易誘發MG，EAMG 血清誘導可使雌鼠AChR 降低40%～50%，而雄鼠則無AChR 數量改變［9］。另外，在動物年齡和體重的選擇上，6～8 周齡、體重140～180 g 的雌性Lewis 大鼠和6～8 周齡、體重14～16 g 的雌性C57BL/6 小鼠為較常用的MG 實驗模型，體重決定自身抗體有效的胞外濃度，這是突觸傳遞過程中的決定因素之一［28］。

本文統計發現使用最多的造模方法為AChR 誘導的EAMG 模型。AChR 誘導的EAMG 模型與人的發病進程相似，具有較高的可行性［9］。其不僅可以探索MG 的發病機制，也可以用于檢測其他抗原的致病性，還可以用于評估降低自身抗體致病效應藥物的治療潛力［29］。但因該模型需要2～3 次增強免疫，對小鼠確定合適的時間窗預防和治療MG 造成一定困難。其主要的造模方法包括電鰩AChR 和人工合成肽段誘導EAMG 模型［30-31］，電鰩AChR誘導EAMG 模型雖然可產生明顯的肌無力癥狀，但AChR 提取困難且純化過程涉及安全問題［32］。因此，近年來多選擇人工合成肽段誘導EAMG 模型，與前者相比，其病程進展緩慢，臨床表現復雜多樣，更加有利于MG 發病機制和治療藥物的研究［33］。AChR-Ab 誘導的PTMG 模型直接將AChR-Ab 注入動物體內，其在抗體注射的48 h 內即可出現典型的肌無力癥狀［34］。但該方法不能檢測靶向淋巴細胞及細胞因子表達或抗原識別的治療劑量，也不會誘發慢性自身免疫性疾?。?5］。其包括通過利用雜交瘤細胞株制備單克隆抗體建立PTMG 模型［29］，建模時間短，發病率高而易于評估，且避免了異質性，適合進行短期研究。被動轉移MG 患者或慢性EAMG 鼠血清中的AChR-Ab，血清中存在各種免疫蛋白及炎癥介質，干擾較大，不能保證單因素影響［36］。向實驗動物腦室中注入MG 患者AChR-Ab建立被PTMG 模型，該方法步驟較復雜，對無菌條件及實驗者的操作水平要求高，在實際操作中存在一定困難［37］。被動轉移AChRa 亞基單克隆抗體，成模率較高，速度快，但臨床癥狀消失快，不符合人類的患病特點［38］。其他還有MuSK 誘導的MG模型和LRP4 誘導的MG 模型等。

137 篇MG 實驗研究文獻中檢測指標多為ELISA 法檢測血清中的生化指標，流式細胞儀分析脾臟和淋巴結、外周血、骨髓等組織細胞，RT-PCR檢測相關基因包括脾臟和淋巴結、肌肉、胸腺等組織淋巴細胞總RNA 及mRNA 的表達等，Western Blotting 法檢測相關蛋白包括脾臟和淋巴結、肌肉、胸腺等組織蛋白檢測，免疫熒光技術包括NMJ 處電生理、形態學和生物化學等。

MG 是一種罕見的自身免疫性疾病，其作用機制尚不明確，病理變化復雜多樣。目前還沒有能夠完全替代涉及多組織和系統的復雜病理的動物模型［26］。在構建MG 實驗模型時常選擇6～8 周齡、體重140～180 g 的雌性Lewis 大鼠和6～8 周齡、體重14～16 g 的雌性C57BL/6 小鼠，采用電鰩AChR或人工合成肽段誘導的EAMG 模型。EAMG 模型不僅可以探索MG 的發病機制，也可以用于檢測其他抗原的致病性，而且還可以用于評估降低自身抗體致病效應藥物的治療潛力。因此，EAMG 模型是研究發病機制和探索新療法的重要工具。然而，與人類疾病相比，EAMG 模型的發病機制更加簡單，因為它是在受控條件下繁殖的同基因動物身上進行的，特別是在遺傳易感性和環境因素方面。