電針通過Parkin 介導的線粒體自噬途徑改善腦缺血再灌注損傷的機制研究

★ 陳阿貞 蘭嵐 謝小文 高麗麗（福建中醫藥大學附屬第二人民醫院 福州 350003）

缺血性腦血管病嚴重危害人類的健康，有發病率高、死亡率高、致殘率高等特點［1-2］。在超早期通過溶栓治療等方式恢復缺血腦組織灌注已被證實是有效治療方法之一，但有研究提示，腦缺血再灌注是加重腦功能損傷的關鍵病理環節，因為再灌注過程中，缺血腦組織可能會因炎癥反應或活性氧積累等而進一步加重，使得缺血性腦卒中治療及預后不佳［3］。針灸作為傳統的治療方法，已廣泛應用于腦血管疾病的治療，并在臨床康復中有良好的治療效果，但其作用機制尚未清楚。本課題前期研究表明，電針曲池、足三里可改善腦缺血再灌注損傷大鼠的運動及認知等功能障礙［4-6］，但其具體作用機制仍需進一步闡明。

近年來研究表明，腦缺血再灌注損傷可使線粒體自噬活化，線粒體自噬的激活能進一步減輕腦缺血再灌注損傷，故線粒體自噬成為干預腦缺血再灌注損傷的重要潛在靶點［7］。已有大量研究表明，PINK1/Parkin 參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程，且上調線粒體自噬水平具有保護神經細胞的作用［8-9］。因此，Parkin 介導的線粒體自噬途徑顯得尤為重要。本課題組前期研究證明了電針在腦缺血再灌注損傷中的多靶點作用，基于線粒體自噬在腦缺血再灌注中的作用，本課題以大腦中動脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠為模型，進一步從Parkin 介導的線粒體自噬途徑揭示電針治療腦缺血再灌注損傷的機制，為臨床電針治療腦缺血性疾病提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

本次實驗選用45 只SPF 級健康雄性SD 大鼠，體重為（250±50）g，動物飼養于福建中醫藥大學SPF 級動物實驗中心，恒溫恒濕，模擬12 h/12 h 晝夜循環光照系統，予以自由飲食及飲水。福建中醫藥大學動物實驗中心動物飼養環境許可證：SYXK（閩）2021-0007。用隨機數字法隨機選取15 只為假手術組，造模成功后的模型大鼠再隨機分為模型組及電針組，各15 只。

1.2 主要材料及儀器

PINK1、Parkin、β-actin 抗體均購于美國Cell Signaling Technology 公司；TUNEL 試劑盒、增強型RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、Tris-Glycine-SDS 電泳緩沖液等購于博士德；華佗牌電針儀（型號SDZ-Ⅱ）購于蘇州醫療用品廠有限公司；超凈工作臺（Opticlean-1300）購于力康生物醫療公司；病理切片機（型號RM2016）購于上海徠卡儀器；Gel DOC 2000 凝膠成像系統、電熱恒溫水槽（型號DK-8AD）均購于上海一恒；瓊脂糖水平電泳儀購于北京六一生物科技有限公司；凝膠玻璃板、固定夾及轉移槽購于美國Bio-Rad公司；HE 成像儀（型號Nikon DS-U3）及超微量紫外可見分光光度計均購于杭州米歐儀器有限公司 ；Image-Pro-Plus 圖像分析系統購于美國Media Cybernetics 公司。

1.3 MCAO 大鼠模型建立

參照Longa 等［10］改良線栓法規范化制備大鼠MCAO 模型。稱重，按0.35 mL/kg 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，從頸正中縱行切開皮膚以暴露左側頸總動脈（CCA），分離頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA）顱外段，并在根部結扎ECA，動脈夾夾閉ICA，在CCA 分叉下方約3 mm 處剪一“V”型小口，緩慢插入頭端圓鈍、直徑約0.25 mm 的尼龍線栓，線栓經CCA 分叉處進入ICA，當有少許阻力時停止插入，松開動脈夾，此時線栓頭端距離分叉處約18 mm，表示線栓頭端已到達大腦中動脈起始端，固定線栓，待缺血90 min 后，撤出線栓以恢復血流再灌注。實驗過程及動物蘇醒期間使用37 ℃恒溫臺進行保溫。待大鼠完全清醒后，采用Zea Longa 法［10］進行神經功能評分，1～3 分者為造模成功，所有造模成功的模型大鼠再按隨機數字法分為模型組及電針組2 組；假手術組大鼠麻醉后只暴露、分離血管后縫合皮膚。動物處理方法經福建中醫藥大學醫學倫理委員會審定，按照中華人民共和國科技部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》執行。

1.4 干預措施

（1）電針組：電針組于MCAO 術后24 h 開始電針治療，干預方法參照中國針灸學會實驗針灸委員會制定的實驗動物穴位圖譜，選取大鼠右側曲池、足三里穴（大鼠穴位定位參考《實驗針灸學》［11］中的定位方法）為電針穴位，選用30 號0.5 寸華佗牌不銹鋼毫針刺入，應用SDZ-Ⅱ電針儀，電流強度為1 mA，波型選擇1/20 Hz 頻率的疏密波，電壓峰值為6 V，以針體輕輕抖動為判斷電針得氣標準，20 min/次，每天同一時間治療1 次，連續7 d。治療結束后放回籠中正常飼養，至7 d 后處死動物取材。（2）模型組：造模結束后回籠飼養，不予任何治療。（3）假手術組：手術后回籠飼養，不予任何治療。

1.5 行為學評定

各組大鼠在腦缺血再灌注后2 h 及電針治療第7 天，由1 名對研究不知情的觀察者按Zea Longa評分［10］評估神經功能改善情況，評分標準：0 分，正常，無神經缺損；1 分，對側前爪不能完全伸展；2 分，活動時向外側轉圈；3 分，行走不穩，不自主向對側傾倒；4 分，完全不能行走，甚至意識喪失。

1.6 取材和指標檢測

1.6.1 取材 干預7 d 后取材，各組大鼠在10%水合氯醛3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉下行開顱，取出的大腦組織迅速保存在-80 ℃冰箱中，或固定后制成石蠟標本備用。

1.6.2 HE 染色 取各組大鼠缺血區域腦組織置于4%多聚甲醛內，4 ℃固定24 h。常規脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5 μm。常規梯度脫蠟入水，脫蠟后蘇木精-伊紅（HE）染色并用中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察各組形態病理學改變。

1.6.3 Western blot 法檢測PINK1、Parkin 提取各組50 μg 左側大腦皮質區腦組織，加入RIPA 裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），充分研磨裂解。勻漿后于冰上靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min 后分離上清液，提取全蛋白提取物。用BCA 法檢測所提取的蛋白濃度。用SDS-PAGE 凝膠電泳，考馬斯亮藍染色標記蛋白質分子量標準，轉膜，用封閉液封閉2 h，加入相應的一抗PINK1（1∶1 000 稀釋）、Parkin（1∶2 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；次日洗滌，加入HRP（辣根過氧化物）標記的二抗（1∶5 000稀釋），振蕩孵育2 h，TBST 洗滌，將膜置于透明塑料板上，將膜蛋白面朝下與混合好的化學熒光發光底物充分接觸，去盡殘液，采用凝膠成像系統顯影成像與分析，內參蛋白為GAPDH，目的蛋白的相對表達量為目的蛋白與內參蛋白的比值。

1.6.4 TUNEL 檢測細胞凋亡數 按TUNEL 試劑盒檢測說明書上操作處理：將腦組織石蠟標本切成約3 μm 厚的切片組織，于玻片上固定。于60 ℃烘箱中烤片后進行二甲苯脫蠟及乙醇溶液梯度水化。封片觀察，在顯微鏡下觀察并采集圖像，計算TUNE 陽性細胞數量。

1.7 數據處理及統計學分析

所收集的數據采用SPSS 25.0 統計軟件分析，計量資料均以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊用LSD 檢驗，方差不齊用Dunnett's T3 檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較

假手術組大鼠無神經功能缺損，均為0 分；造模后，與假手術組相比，模型組與電針組大鼠神經功能缺損評分均明顯升高（P＜0.05），但模型組與電針組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；經電針干預治療，電針組大鼠神經功能缺損評分較模型組顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較（±s，n=15）分

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較（±s，n=15）分

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

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2.2 各組大鼠腦皮質區神經元結構變化比較

假手術組神經元排列整齊，分布均勻，神經元胞體較大，未見明顯空泡，核呈圓形，核仁清晰可見；模型組神經元皺縮，分布凌亂，胞質變形縮小，結構不清，核固縮，呈三角形，細胞周圍間隙增寬，可能是炎性細胞；電針組神經細胞核皺縮或碎裂有所減少，細胞浸潤減少，一定程度上減輕缺血再灌注所致的病理損傷。見圖2。

圖2 各組大鼠腦皮質區HE染色結果（20×）

2.3 各組大鼠腦缺血皮質區PINK1、Parkin 蛋白表達比較

與假手術組相比，模型組大鼠腦缺血皮質區線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin 表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠皮質組織PINK1、Parkin水平進一步升高（P＜0.01），表明電針可上調PINK1、Parkin 表達，激活線粒體自噬。見圖3。

圖3 各組大鼠腦缺血皮質區PINK1、Parkin蛋白表達比較

2.4 各組大鼠腦皮質區細胞凋亡率的比較

與假手術組相比，模型組細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），而電針組的細胞凋亡率較模型組明顯下降（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠腦皮質區細胞凋亡率的比較

3 討論

中醫學認為，中風病的基本病機總屬陰陽失調，氣血逆亂，主要病位在腦，臨床上常表現為半身不遂、偏身麻木等。根據《素問·痿論》“治痿獨取陽明”理論，曲池和足三里均是陽明經上的合穴，對治療缺血性中風具有良好的臨床療效，這已在大量臨床研究中得到證實［12］。腦缺血再灌注損傷大鼠模型（MCAO 模型）產生的神經功能缺損癥狀與腦缺血患者的臨床癥狀相似，常伴有肢體的運動及感覺障礙等。本研究結果顯示，電針可以改善神經功能缺失癥狀，減少腦缺血再灌注損傷大鼠的炎性反應，神經行為學評分及病理學結果很好地證實了這一點，這與既往報道相符［13-14］，表明電針具有治療腦缺血再灌注損傷的作用。

腦缺血再灌注損傷會產生鈣離子超載、炎性反應、細胞凋亡、自由基氧化損傷等在內的一系列復雜反應，最終導致細胞死亡［15］。線粒體作為細胞內的關鍵細胞器，在細胞能量產生、氧化磷酸化、細胞死亡等過程中起重要的作用，其作為細胞能量代謝的中心，為大腦提供重要的能量。大量研究表明線粒體受損會加重缺血性腦損傷神經元細胞的凋亡［16］。因此，及時對受損的線粒體進行清除可以有效減輕腦缺血再灌注損傷。當前國內外研究發現，線粒體自噬是機體通過特異性自噬將受損線粒體消除的重要方式之一［17-18］。而在腦缺血灌注過程中線粒體自噬受多種蛋白的調節，其中，PINK1/Parkin 通路調控的線粒體自噬途徑最為典型［19］。Parkin 主要通過介導底物泛素化進行信號傳導，調節蛋白降解等而誘發線粒體的自噬，PINK 是受損傷線粒體的分子感受器，可通過募集并活化Parkin 進一步引發線粒體自噬，是線粒體受損時的第一道防線。已有研究揭示，在腦缺血再灌注損傷中，當線粒體自噬發生時，腦神經元細胞內PINK1 蛋白表達升高，Parkin 被活化，Parkin 敲除后，PINK1 也可通過泛素蛋白磷酸化誘導低水平線粒體自噬，這表明Parkin 的存在會增加PINK1誘導的信號通路，增強線粒體自噬過程［20］。本動物實驗中，造模成功后大鼠腦組織中的線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin 的表達水平升高，說明腦缺血再灌注損傷后存在自噬蛋白的活化，這與此前大量的研究報道一致［21-22］。而進一步研究發現，電針干預后可進一步提高PINK1 及Parkin 蛋白水平，這表明在腦缺血再灌注損傷中，電針可能通過上調PINK1/Parkin 通路介導的線粒體自噬水平發揮神經保護作用。

最新研究表明，線粒體受損可以通過促進腦缺血再灌注損傷的炎癥聯級反應，引發細胞凋亡，從而加重腦損傷［23］。已有研究證實PINK1/Parkin 介導的線粒體自噬作為一種清除受損線粒體的途徑，在腦缺血再灌注中起重要作用［24］。通過激活線粒體自噬可以減輕腦缺血神經元損傷，進而減少線粒體依賴的細胞凋亡，這已經在體內模型和培養的神經元中得到證實［25］。故本課題組進一步應用TUNEL 染色法檢測電針對腦缺血再灌注區細胞凋亡的影響。結果表明MCAO 組大鼠腦缺血區存在大量細胞凋亡，電針干預后細胞凋亡數明顯減少，神經功能缺損癥狀明顯改善，與相關研究一致。這也表明電針通過介導線粒體自噬途徑減輕腦缺血再灌注損傷神經細胞的凋亡。

綜上所述，本研究結果表明，電針MCAO 大鼠曲池、足三里可能通過激活Parkin 介導的線粒體自噬途徑減少細胞凋亡，減輕腦缺血再灌注神經損傷，從而起到腦保護的作用。但調控線粒體自噬的信號通路多樣，電針能否通過其他途徑調控線粒體自噬產生神經保護作用，其具體作用機制仍需進一步研究。