Ag 對Ag-ZnO 納米抗菌涂層微觀結構和性能的影響

李 偉，張 卓，張鐠丹，章 浩，馬 迅

（1.上海理工大學 材料與化學學院,上海 200093；2.上海長海醫院 創傷骨科,上海 200433）

Ti6Al4V 螺釘在骨科手術中廣泛應用于治療骨折、骨骼畸形和關節置換等骨骼問題[1]。盡管Ti6Al4V 具有許多出色的性能特點，但它們無法有效抵御金黃色葡萄球菌等致病菌的粘附和生長[2]，容易在其表面形成生物膜，進而導致嚴重的感染和植入失敗。近年來，隨著對抗生素耐藥性的菌株的增多，人們重新關注無機抗菌劑，如Ag[3]、Cu[4]和Zn[5]等，將無機抗菌劑應用于Ti6Al4V 螺釘表面有望成為解決骨科植入體感染問題的方法。

抗菌涂層可涂覆在骨科 Ti6Al4V 螺釘表面以防止細菌粘附和生物膜的形成[6]，這些涂層通常被設計成能在一段時間內釋放抗菌物質，如Ag+或Zn2+等金屬離子，以抑制細菌生長[7-8]。在各項研究中，使用抗菌涂層可以有效減少細菌的附著和生物膜的形成。Diez-Escudero 等[9]在多孔Ti6Al4V 表面鍍Ag，顯著降低了金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等常見病原體形成生物膜的風險，促進骨骼愈合。另一項體外研究[10]表明，與無涂層的不銹鋼或鈦植入物相比，有Ag 涂層的可以顯著減少細菌數量。Abdulkareem 等[11]利用電流體動力學沉積技術將ZnO 納米粒子和HA 納米粒子包覆在Ti 植入體上，其抗菌率達90%以上。Ag 還被證明具有抗病毒和抗真菌的特性[12]。

盡管Ag 作為抗菌劑具有很多優點，人們仍然擔心其安全性和潛在的副作用。Ag+可以與人體細胞中的蛋白質和酶結合，導致細胞功能障礙和細胞死亡[13]。然而有研究[14]表明，Ag 對人體細胞的傷害比對細菌細胞的要小，其毒性取決于Ag+的濃度和接觸時間。因此，通過合理控制涂層中Ag 和Zn 等抗菌劑的含量有望開發出符合人體安全標準的植入體抗菌涂層，對解決骨科植入體感染這一術后并發癥問題具有重要意義。

本試驗通過射頻磁控濺射技術，調整Ag、ZnO 和Ti 3 種靶材的體積比，在Ti6Al4V 表面研制出Ag 質量分數具有梯度變化的Ag-ZnO/Ti 復合抗菌涂層，研究了Ag 質量分數的變化對Ag-ZnO/Ti涂層的微觀形貌、表面粗糙度、接觸角以及Ag+和Zn2+釋放速率的影響，并采用CCK-8（Cell Counting Kit-8 試劑）法和共培養-平板涂布法重點研究了Ag-ZnO/Ti 復合涂層的細胞毒性和抗菌活性，最終探究了涂層中Ag 質量分數的變化對涂層微觀形貌以及對金黃色葡萄球菌抗菌性能的影響。

1 試驗材料及方法

1.1 涂層的制備

采用JGP-450 型高真空磁控濺射薄膜沉積系統制備Ag-ZnO/Ti 復合抗菌涂層，所使用的靶材由體積分數為1%、2%、3%、4%的Ag 靶材、固定體積分數2%的ZnO 靶材、Ti 靶材3 種靶材拼接而成，拼接靶材直徑50 mm、厚度3 mm?；走x用了直徑10 mm×厚度1 mm 的Ti6Al4V 片。沉積涂層時使用的靶材如圖1 所示，將分別鑲嵌了體積分數1%、2%、3%和4%Ag 靶材的復合靶材制備出的樣品依次命名為1-Ag/Zn 組、2-Ag/Zn 組、3-Ag/Zn 組和4-Ag/Zn 組。當基底和靶材安裝完畢后開始抽真空，當真空度下降至6×10-4Pa 以下時，對腔體通入氬氣，氬氣流量30 sccm，沉積功率35 W，自轉速率5 r/min，預濺射15 min 清除靶材表面的氧化物等雜質，其中預濺射采用的氣壓為8 Pa。以上準備工作完成后，調整氣壓至75 ×10-2Pa 并轉動擋板，開始沉積涂層，待沉積完畢后，取出樣品密封保存。

圖1 Ag、ZnO 和Ti 靶材拼接示意圖Fig.1 Splicing diagram of Ag,ZnO and Ti targets

1.2 涂層的結構及性能表征

采用D8 Advance X 射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）對涂層進行物相分析，檢測方法為廣角X 射線衍射法，取30°～80°范圍的衍射角，以4(°)/min 的速度進行掃描。采用Zeiss Sigma-300 型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察涂層表面形貌。采用Dimension Icon 原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）對涂層的微觀三維形貌及表面粗糙度進行表征。采用JC2000C1 型接觸角測量儀反映涂層表面的潤濕性。采用JXA-8530F Plus 場發射電子探針顯微分析儀（electron probe X-ray micro-analyser，EPMA）測定涂層的化學成分。

1.3 涂層的離子釋放試驗

在本研究中，采用美國安捷倫公司生產的Agilent 720ES 電感耦合等離子體質譜儀（inductively coupled plasma mass spectrometer，ICP-MS）測定涂層在不同時間點（12、24、36、48、72 h）釋放出的Ag+和Zn2+的濃度。具體測試時每次取1 mL 同組試管中的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）檢測其中Ag+和Zn2+濃度，同時對試管補加相同體積的PBS。以上測試每組樣品重復3 次。

1.4 涂層的細胞毒性試驗

本試驗通過CCK-8 法測定在不同時間點（12、24、36、48、72 h）大鼠骨髓間充質干細胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs）的活力值，以判斷涂層的細胞毒性是否符合生物安全標準。試驗采用對數生長期的rBMSCs，按上述分組處理，將細胞按照1.5×104的密度接種到96 孔板中，然后置于恒溫培養箱內在5%（體積分數）CO2和37 ℃的條件下培養24、72、120 h。在每個培養完成的時間點移除培養基，用PBS 洗滌各孔3 次并加入1 000 μL含 10%（體積分數）CCK-8 的培養基，然后再次放進5%CO2和37 ℃的恒溫培養箱中培養2 h。最終培養完成后，每孔取800 μL 的上清液到新的24 孔板中，用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度。

對每組樣品的細胞相對活力（relative growth rate，RGR）采用以下公式計算：

式中：RGRx代表編號為x的樣品組的細胞相對活力；Ox則是其對應的吸光度；O1為空白組 Ti6Al4V的吸光度；Ob為背景吸光度，即多孔板本身未加培養基和細胞的吸光度。將得到的各組的RGR按照表1 對其細胞毒性進行分級。

表1 細胞毒性分級判斷標準Tab.1 Criteria for grading cytotoxicity

1.5 涂層的抗菌性能試驗

采用共培養-平板涂布法測試涂層對金黃色葡萄球菌的抗菌性能。將樣品放入24 孔板中，用移液器在對應的孔中依次滴入500 μL 的菌懸液。再將載有樣品和菌懸液的24 孔板放入恒溫培養箱，在37 ℃恒溫條件下共培養24 h。待培養完成后，從培養箱中取出24 孔板，通過輕微振動以分離樣品表面上的菌懸液使其脫落，然后移除孔中的共培養樣品并收集孔中的菌懸液，將后者轉移到無菌容器中用PBS 稀釋后用于平板涂布，通過涂布棒均勻涂布在這些平板的表面。對平板編號后放入37 ℃恒溫培養箱，24 h 后取出瓊脂平板對其表面的菌落數量進行統計。為了定量比較各組樣品的抗菌效果，本試驗采用抑菌率計算樣品的抗菌性能，計算公式如下：

式中：Rx代表編號為x的樣品的抑菌率；C1代表空白組瓊脂平板表面的菌落數量（CFU/片）；Cx代表第x組瓊脂平板表面的菌落數量（CFU/片）。參考國家標準《HG/T 3 950-2007》中對涂層抗菌性能的劃分標準，可以對樣品組的抗菌性能進行分級：當Rx≥99%時，樣品具有強抗菌性，為I 級；當90%≤Rx≤99%時，樣品具有抗菌性，為II 級。

2 結果與討論

2.1 微觀形貌

各組樣品表面SEM 圖如圖2 所示，Ag-ZnO/Ti復合涂層樣品的表面都形成了球形納米顆粒，間距清晰且分布均勻，平鋪在整個基底表面上。其中1-Ag/Zn 組涂層表面的納米顆粒最為細小，平均粒徑僅為26 nm，間距最大。隨著Ag 質量分數的遞增，納米顆粒的尺寸和數量都有所增加，大顆粒間平鋪了致密的小顆粒，表面形貌粗糙。

圖2 Ag-ZnO/Ti 復合涂層表面SEM 圖Fig.2 SEM images of Ag-ZnO/Ti composite coating surfaces

圖3 為Ag-ZnO/Ti 復合涂層樣品的XRD 譜圖。圖3 中僅能觀察到3-Ag/Zn 組和4-Ag/Zn 組中Ag（111）晶面和Ag（220）晶面的衍射峰，未觀察到ZnO 的結晶峰，可能與其含量較低有關。涂層表面納米顆粒的數量和粒徑尺寸上有所增長，是因為Ag 在涂層表面上形成了更多的成核位點，有利于納米顆粒的形成并吸附更多的Ag，從而快速長大，因此，Ag-ZnO/Ti 復合涂層中的Ag 傾向于以納米顆粒堆垛的形式長大，從而形成連續薄膜或涂層。

圖3 Ag-ZnO/Ti 復合涂層的XRD 譜圖Fig.3 XRD patterns of the Ag-ZnO/Ti composite coatings

表2 總結了各組樣品EPMA 表征結果，隨著拼接靶材中Ag 靶體積比的增大，Ag 質量分數由0.77%增長到了3.63%。盡管ZnO 靶材體積不變，但涂層中Zn 質量分數出現了微量的增長，這是因為濺射氣氛中活躍的Ag 與ZnO 靶材發生碰撞，從而將更多的動能傳遞給了ZnO，使其掙脫表面結合能成為離位原子并濺射在基底表面。

表2 Ag-ZnO/Ti 復合涂層中Ag、Zn 和Ti 的質量分數Tab.2 Mass fractions of Ag,Zn and Ti in Ag-ZnO/Ti composite coatings

由圖4 復合涂層的 AFM 圖可知，隨著Ag 質量分數的遞增，納米顆粒的數目逐漸增多，表面逐漸粗糙，與SEM 結果一致，證實了Ag 對Ag-ZnO/Ti 復合涂層表面形貌的影響。其中，3-Ag/Zn 組樣品表面出現納米粒子團聚現象，4-Ag/Zn 組中團聚現象消失，表面的納米顆粒密度更高，均勻性更好。

圖4 Ag-ZnO/Ti 復合涂層的AFM 圖Fig.4 AFM images of the Ag-ZnO/Ti composite coatings

表3 為復合涂層表面輪廓算數平均偏差。由表3 可知，Ag-ZnO/Ti 復合涂層的表面粗糙度隨著涂層中Ag 含量的增加而不斷升高。當Ag 質量分數為3.63%時，樣品組表面粗糙度為6.71 nm，達到了最大。據Bollen 等[15]的研究結果顯示，當表面粗糙度小于0.2 μm 時，此表面對附著在其上的細菌總量影響不大。盡管4 組樣品的表面粗糙度不斷增大，但由于均遠遠小于0.2 μm，因此并不會導致更多的細菌在其表面粘附。

表3 Ag-ZnO/Ti 復合涂層表面輪廓算數平均偏差Tab.3 Arithmetic mean deviation of the Ag-ZnO/Ti composite coatings

2.2 潤濕性能

表面潤濕性是與生物材料相關的一項重要性能，材料與水的接觸角與細菌的粘附之間存在直接關系[16]，據報道，細菌更傾向于在親水性表面粘附[17]。圖5 為樣品表面與液相的接觸角，隨著Ag 質量分數的增加，Ti6Al4V 表面由親水表面轉變為疏水表面，其中，4-Ag/Zn 組疏水性最佳，有利于抑制細菌的粘附。根據Wenzel's 方程，當材料表面的接觸角大于90o時，增加材料表面粗糙度會使其接觸角也隨之增大[18]。本研究各組樣品接觸角變化與其表面粗糙度的變化相符合。

圖5 Ag-ZnO/Ti 復合涂層表面與水的接觸角Fig.5 Water contact angles on the surface of Ag-ZnO/Ti composite coatings

2.3 Ag+和Zn2+釋放速率

圖6 為各組樣品在PBS 中浸泡72 h 釋放出的Ag+和Zn2+的濃度，涂層中的Ag 和Zn 在富含水分的環境中能以金屬離子的形式連續釋放到周圍的介質中。由圖6（a）可知，Ag+在36 h 內快速釋放，36 h 后，Ag+的釋放速率減緩，直到72 h 時仍保持在相對較高的水平未出現明顯下降，基本符合理想的離子釋放曲線。Kim 等[19]研究發現當Ag+的濃度超過300 mg/L 時才能引起輕度肝損傷。相比于Ag+，圖6（b）中Zn2+釋放速率增長較為穩定，直到48 h 時達到了最高，但整體Zn2+的濃度大大低于Ag+的濃度，因此，各組樣品在72 h 內的離子釋放濃度均為安全濃度。

圖6 Ag-ZnO/Ti 復合涂層浸泡不同時間釋放出的金屬離子濃度Fig.6 The concentrations of metal ions released by the Ag-ZnO/Ti composite coating samples soaked in different time

2.4 細胞毒性

圖7 為背景多孔板、空白組Ti6Al4V 以及各組涂層分別在24、72、120 h 時測得的吸光度，對應的RGR已在表4 中給出。含Ag 涂層組之間無顯著性差異（P＞0.05），4 組樣品與空白組Ti6Al4V 的吸光度差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 Ag-ZnO/Ti 復合涂層與rBMSCs 細胞共培養不同時間的RGRTab.4 The RGR of rBMSCs cocultured with Ag-ZnO/Ti composite coating in different time

圖7 Ag-ZnO/Ti 復合涂層與rBMSCs 細胞共培養不同時間吸光度的比較Fig.7 Comparison of absorbances of Ag-ZnO/Ti composite coating and rBMSCs co-cultured in different time

生物相容性是與生物材料相關的最重要的性能之一。表5 中1-Ag/Zn 組和2-Ag/Zn 組的RGR均在75%以上，對應的細胞毒性僅為Ⅰ級，符合安全的毒性標準，可用于動物試驗等進一步研究。3-Ag/Zn 組在72 h 內的RGR表明其對人體可能存在安全風險，其毒性等級為Ⅱ級，而在120 h 后達到了Ⅰ級的安全標準。4-Ag/Zn 組的吸光度在24、72、120 h 的時間點均為最低，其中在24 h 的RGR僅為33.51%，毒性等級達到了Ⅲ級，表明該涂層對生物細胞存在著極高的安全風險，不符合人體安全標準。因此，以該組涂層中Ag 質量分數1.85%的作為本研究的臨界安全含量，即2-Ag/Zn 組涂層。

表5 Ag-ZnO/Ti 復合涂層平板菌落計數結果Tab.5 Sample plate colony count results of Ag-ZnO/Ti composite coatings

2.5 抗菌性能

各組樣品平板涂布抑菌結果如圖8 所示。涂覆Ag-ZnO/Ti 復合涂層后，試驗組對金黃色葡萄球菌表現出顯著的抗菌效果，能夠殺滅絕大部分的細菌，平均抑菌率在90%以上。其中，雖然1-Ag/Zn 試驗組的Ag 質量分數僅為0.77%，但仍達到了97.7%以上的抑菌率。如圖9 所示，根據國家標準《HG/T 3 950-2007》中關于抗菌涂料的規定可達到Ⅱ級抗菌性，而4-Ag/Zn 試驗組的平板表面已幾乎看不到細菌菌落。整體4 組試驗組表現出隨涂層中Ag 含量增加而明顯提高的抗菌性能，其中2-Ag/Zn 組、3-Ag/Zn 組和4-Ag/Zn 組的抑菌率分別約為99.03%、99.62%、99.98%，都具有Ⅰ級的抗菌性能。

圖9 Ag-ZnO/Ti 復合涂層對金黃色葡萄球菌的抗菌率Fig.9 Antibacterial ratios of Ag-ZnO/Ti composite coatings against Staphylococcus aureus

據報道[20]，當細菌在植入體表面形成生物膜后其耐藥性會大幅增加。生物膜會充當細菌的保護層阻擋來自宿主免疫系統和抗菌劑的殺傷作用[21]，而攜帶納米粒子抗菌劑的涂層可以穿透細菌生物膜[22]，為植入部位提供較高初始濃度的抗菌劑，并在傷口愈合前持續釋放[23]。納米Ag 和納米ZnO 的抗菌機制可以歸納為以下幾點：

（1）降低細菌細胞膜電位差使其功能受損：細菌的細胞膜一般處于負電位，很容易通過靜電作用吸附Ag+和Zn2+等金屬離子導致自身細胞膜電位失衡，使膜去極化并改變其通透性。當電位差降低過多時可導致細胞膜破裂，使細菌死亡[24]。

（2）與細菌細胞內的生物分子結合使其結構受損：Ag+和Zn2+能夠與細菌細胞內的蛋白質和DNA結合，使其結構異常進而導致功能受損，最終使細菌細胞無法行使正常的生理功能而死亡[25]。

（3）介導活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生會誘導氧化應激：Ag+和Zn2+通過產生ROS 間接發揮抗菌作用[26]，ROS 不僅能導致細菌的細胞膜脂質過氧化，還能攻擊細菌細胞內的生物分子，導致蛋白質羰基化、DNA 斷裂等嚴重后果，誘導細菌的急性死亡。

3 結論

本試驗探究了Ag 含量的變化對Ag-ZnO/Ti 復合涂層微觀形貌和抗菌性能的影響，具體結論如下：

（1）采用射頻磁控濺射技術制備的Ag-ZnO/Ti 復合涂層表面質量良好，通過提高拼接靶材中Ag 的體積比，涂層表面納米顆粒數量顯著增加，表面粗糙度增大，當Ag 質量分數達到1.85%時，其表面粗糙度也達到了最大，Ra為4.24 nm。同時，其疏水性得到增強，與水的接觸角最大達到了96.7o，有助于減少細菌的粘附。

（2）Ag-ZnO/Ti 復合涂層釋放出的Ag+濃度在36 h 時已接近最大值，直到72 h 仍保持小幅增長。Zn2+的濃度在48 h 時達到最大，且仍有上升趨勢。

（3）Ag-ZnO/Ti 復合涂層可以顯著改善Ti6Al4V材料的抗菌性能。樣品的抗菌率與靶材中Ag 的含量成正比，然而基于生物相容性的考慮，當靶材體積比為Ag∶ZnO∶Ti=2∶2∶96 時，RGR在75%以上，毒性等級為I 級，符合生物材料的安全標準，同時，樣品抗菌率高達99.62%，具有I 級抗菌性。