HPLC-DAD法同時測定芪防敗毒合劑中綠原酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

鄭乾文，楊 輝，林 靜，尤文質，蘇娟娟，許光輝，羅友華，陳雪梅*

（1.廈門市中醫院，福建 廈門 361009；2.廈門市醫藥研究所，福建 廈門 361008；3.廈門市天然藥物研究與開發重點實驗室，福建 廈門 361008）

芪防敗毒合劑系廈門市中醫院制劑室配制的院內制劑，由黃芪、麩炒白術、防風、金銀花等9 味飲片組成，具有益氣固表、透邪敗毒的功效。該方由玉屏風散加減，經廈門市中醫院中醫藥防治呼吸道傳染病專家組共同研討制定，用于治療表虛不固、外感邪毒、發熱身倦、自汗惡風、面色?白或體虛易感易病者［1］。該制劑已獲福建省藥品監督管理局備案（制劑備案號：閩藥制備字Z20230001000）。

根據芪防敗毒合劑的組方依據，本文選擇方中君藥黃芪和佐藥金銀花的有效指標成分進行含量測定，以提高該制劑的質控水平?！吨腥A人民共和國藥典》規定了黃芪中黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（calycosin 7-O-β-D-glucopyranoside，CG）和金銀花中綠原酸（chlorogenic acid，CA）的含量限度［2］。由于黃芪甲苷無紫外吸收，需使用蒸發光散射檢測器，使用較不方便，因此，本文未建立芪防敗毒合劑中黃芪甲苷的含測方法。本文采用二極管陣列檢測器（DAD），建立了HPLC 多波長法同時測定芪防敗毒合劑中CG 和CA 的含量，為該制劑工藝優選和質量標準制定提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS205 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，d=0.01 mg）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）。

1.2 試藥 甲醇、乙腈均購自美國Tedia 公司（色譜純，批號：21070347、21010427）；磷酸（分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司，批號：20210530）；自制超純水；CA 對照品（純度為96.3%）、CG 對照品（純度為96.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110753-202119、111920-201907）。

黃芪、麩炒白術、防風、金銀花等9 味飲片購自國藥控股廈門有限公司，經廈門市中醫院尤文質副主任藥師鑒定，所用飲片均符合2020 年版《中華人民共和國藥典》要求。芪防敗毒合劑（批號：20221201、20221202、20221203）由廈門市中醫院制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～11 min，11%A；11～12 min，11%～22%A；12～17 min，22%～25%A；17～18 min，25%～100%A；18～21 min，100%A；21～21.1 min，100%～11%A；21.1～25 min，11%A）；流速1 mL/min；CA、CG 檢測波長分別為326、260 nm；進樣量5 μL；柱溫30 ℃。CA 峰的理論塔板數≥8 000，CG 峰的理論塔板數≥10 000。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取CA 對照品和CG 對照品適量，用50%甲醇定容制成467.14、28.09 μg/mL 混合對照品儲備液。分別精密吸取該混合對照品儲備液100、249、498、747、997、1 246、1 495、1 744、1 993 μL，置于5 mL 量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，得到CA 質量濃度分別為9.34、23.26、46.53、69.79、93.15、116.41、139.67、162.94、186.20 μg/mL，CG 質量濃度分別為0.56、1.4、2.8、4.2、5.6、7、8.4、9.8、11.2 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取芪防敗毒合劑1.5 g，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇混勻定容，靜置30 min后，用0.45 μm 尼龍膜過濾，取續濾液即得供試品溶液。

2.2.3 陰性供試品溶液 分別稱取不含金銀花和不含黃芪的芪防敗毒合劑陰性處方1.5 劑，按芪防敗毒合劑制備工藝，分別制得缺金銀花和缺黃芪的陰性芪防敗毒合劑。分別精密稱取陰性芪防敗毒合劑各1.5 g，按“2.2.2”項下方法制備缺金銀花陰性供試品溶液、缺黃芪陰性供試品溶液。

2.3 HPLC 方法學驗證

2.3.1 系統適應性試驗 按“2.1”項下色譜條件，分別測定混合對照品溶液、供試品溶液、缺黃芪陰性供試品溶液、缺金銀花陰性供試品溶液和50%甲醇溶劑空白溶液，記錄色譜圖。供試品溶液中CG和CA 分離度和理論板數均符合要求，陰性無干擾，說明建立的HPLC 方法系統適用性良好。見圖1、圖2。

圖1 芪防敗毒合劑中CA 的高效液相色譜圖

圖2 芪防敗毒合劑中CG 的高效液相色譜圖

2.3.2 線性關系考察 取“2.2.1”項下不同濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。以各成分對照品峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得各成分回歸方程。結果顯示：CA 的線性方程為Y=16.095X-4.771 1，r=0.999 7，線性范圍為9.34～186.20 μg/mL；CG 的線性方程為Y=16.48X-0.427 1，r=0.999 7，線性范圍為0.56～11.20 μg/mL，說明CA 和CG 分別在上述范圍內的線性關系良好。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取芪防敗毒合劑（批號：20221201）6 份，每份1.5 g，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件測定。結果顯示芪防敗毒合劑中CA、CG含量均值分別為0.593 0、0.039 5 mg/g，RSD 分別為3.22%、3.53%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 進樣精密度試驗 取供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，連續進樣6 次，分別記錄CA、CG 峰面積并計算RSD 分別為0.26%、0.86%，表明該方法進樣精密度良好。

2.3.5 儀器精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，連續進樣6 次，計算CA、CG 峰面積的RSD 分別為0.21%、0.23%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 中間精密度試驗 第2 天，與重復性試驗不同的實驗人員按“2.2.2”項下方法，平行制備芪防敗毒合劑（批號20221201）供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件進行測定，連續進樣6 次，計算CA、CG 含量的RSD 分別為1.50%、1.60%，表明中間精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 取芪防敗毒合劑（批號：20221201）供試液，于制備后0、5、8、12、16 h 分別按“2.1”項下色譜條件測定，計算CA、CG 峰面積的RSD 分別為1.97%、3.93%，表明供試品溶液在16 h內穩定。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的芪防敗毒合劑（批號：20221201，CA 含量為0.616 2 mg/g，CG 含量為0.050 0 mg/g） 9 份，分別置10 mL 量瓶中，再分別按接近1∶1 的比例加入混合對照品溶液，用50%甲醇定容后，搖勻，用0.45 μm 尼龍膜濾過，取續濾液，作為回收率供試品溶液。分別按“2.1”項下色譜條件測定，分別計算CA 和CG 的加樣回收率和RSD。

結果顯示：CA 回收率為104.02%～111.77%，平均回收率為107.63%，RSD 為2.91%，符合2020 年版《中華人民共和國藥典》中回收率限度80%～115%、RSD 限度6%的要求，見表1。CG 的回收率為98.43%～107.32%，平均回收率為103.17%，RSD為2.86%，符合2020 年版《中華人民共和國藥典》中回收率限度80%～115%、RSD 限度6%的要求，見表2。

表1 CA 加樣回收率試驗結果

表2 CG 加樣回收率試驗結果

2.4 芪防敗毒合劑中CA、CG 含量測定 取3 批芪防敗毒合劑樣品，按“2.2.2”項下方法，每批平行制備供試品溶液2 份，按“2.1”項下色譜條件測定，計算芪防敗毒合劑中CA、CG 含量。3 批芪防敗毒合劑中，CA 含量范圍為0.748 9～0.831 6 mg/g，CG 含量范圍為0.058 0～0.054 2 mg/g。見表3。

表3 芪防敗毒合劑中CA、CG 含量測定結果 mg/g

3 討 論

3.1 有效指標成分的選擇 基于傳統功效、化學成分有效性、可測性、植物親緣學及藥動學等進行質量標志物預測分析，黃芪甲苷等皂苷類可作為黃芪的質量標志物［3］。金銀花是治療瘟疫的主要藥物，其CA 等酚酸類成分能抑制多種炎癥因子的表達，還能阻止SARS-CoV-2 侵入人體，可見，金銀花的CA 等酚酸類成分可作為治療COVID-19 的潛在活性成分［4］。因此，根據芪防敗毒合劑的組方依據和2020 年版《中華人民共和國藥典》質量標準，本文選擇合劑中CG 和CA 作為芪防敗毒合劑方中君藥黃芪和佐藥金銀花質量控制中含測有效指標成分。芪防敗毒合劑處方中白術［5］、防風［6］等飲片也有抗病毒活性，將采取定性鑒別法對其進行質量控制。

3.2 檢測波長的選擇 在DAD 檢測器上分別讀取CG 對照品和CA 對照品的190～400 nm 波長范圍光譜圖，CG 的最合適波長為260 nm，CA 的最大吸收波長為326 nm，2020 年版《中華人民共和國藥典》記載黃芪中CG、金銀花中CA 的檢測波長分別為260、326 nm，故選擇這2 個波長分別測定CG 和CA 的含量。

3.3 供試品溶液稀釋溶劑種類的優選 分別采用水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇、50%乙腈、乙腈等溶劑制備供試品溶液，發現水為溶劑測得CA和CG 含量均很低；50%甲醇測得CA 含量第2 高，相對均差較??；甲醇產生很多粥樣沉淀，CA 含量較低；50%乙醇測得CA 含量最高，相對均差較大；乙醇產生團塊沉淀，操作穩定性較低；50%乙腈測得CG 含量第2 高，但CA 含量較低；乙腈導致很多浸膏未溶化，2 個成分含量均最低。所以，制備芪防敗毒合劑供試品的稀釋溶劑初步選擇50%甲醇。

3.4 甲醇濃度的優選 分別用100%、90%、80%、70%、60%、50%甲醇制備供試品溶液，發現CA 含量用50%甲醇稀釋最高，80%甲醇和100%甲醇第2 高，CG 含量用100%甲醇最高，50%甲醇次之。為了節約甲醇用量，確定以50%甲醇制備芪防敗毒合劑供試品溶液最好。

本文根據文獻［7-9］，結合多次預實驗，建立了HPLC-DAD 法同步測定芪防敗毒合劑CG 和CA的含量，經系統適應性試驗、線性及線性范圍、準確度、精密度等方法學驗證，結果表明本文建立的HPLC 法符合2020 年版《中華人民共和國藥典》相關要求，具有操作簡便、準確高效、節能環保等優點，為芪防敗毒合劑的工藝研究和質量標準制定奠定基礎。