ω-氨甲基長葉烯的合成、表征及其抑菌活性

盧平平, 黃焰群, 甘月紅, 黃蘭杰, 葛 海, 黃道戰*

(1.廣西民族大學 化學化工學院;林產化學與工程國家民委重點實驗室,廣西 南寧 530008; 2.廣西林產化學與工程重點實驗室;廣西林產化學與工程協同創新中心,廣西 南寧 530008; 3.廣西民族大學 材料與環境學院,廣西 南寧 530105)

長葉烯是重質松節油的主要成分[1],具有獨特的分子結構和松木似的木香香氣,還對細菌[2-3]、真菌[4]、藻類[5-6]的生長有一定的抑制作用,在香料、醫藥、農藥等行業有重要的應用及發展潛力。鑒于長葉烯易揮發、弱親水性,人們利用Prins烯醛縮合、Vilsmeier-Haack 甲?；确磻?在不改變長葉烯分子結構的基礎上,通過構筑可增強親水性和生物活性的官能團,合成含長葉烯分子結構、具有適宜親水親油性和較高生物活性的衍生物,如ω-氯甲基長葉烯[7]、長葉烯基季銨鹽、N-取代苯并異噻唑[8]等,這已經成為研發長葉烯深加工新產品、拓展其新應用領域的有效途徑之一。烯丙胺作為一種重要的生物活性功能基團[9],廣泛存在于許多天然和合成藥物分子中,例如辣椒堿、萘替芬、特比萘芬和布替萘芬等抗真菌藥物[10-11]。為進一步拓展長葉烯的應用領域,本研究以前期合成的化合物ω-氯甲基長葉烯為原料,采用Gabriel伯胺合成法[12-13],進一步構筑烯丙胺功能基團,合成了含長葉烯結構的烯丙胺類化合物ω-氨甲基長葉烯,優化了ω-氨甲基長葉烯的合成工藝,表征了化合物的結構,并考察了化合物對幾種常見致病性細菌和真菌的抑菌活性。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

長葉烯(1),廣西梧松林化集團有限公司;ω-乙酰氧甲基長葉烯(2,GC純度95%)和ω-氯甲基長葉烯(3,GC純度95%),按參考文獻[8,14]方法實驗室自制。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、鄰苯二甲酰亞胺鉀、石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、 80%水合肼、二甲亞砜(DMSO)、氫氧化鈉和無水硫酸鈉等,均為市售分析純試劑。供試細菌4株,其中革蘭氏陽性菌2株,為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC-25923、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) ATCC-6633,以及革蘭氏陰性菌2株,為大腸桿菌(Escherichiacoli) ATCC-8739、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae) ATCC-4352;供試真菌3株,分別為白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC-10231、熱帶念珠菌(Candidatropicalis) ATCC-13803、黑曲霉(Aspergillusniger) ATCC-16404,北京北納創聯生物技術研究所。

Magna-IR 550型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀,美國Nicolet公司;XT-4型顯微熔點儀,北京泰克儀器有限公司;Bruker AscendTM400 MHz核磁共振波譜(NMR)儀,瑞士Bruker公司;Xevo G2-S QTof型超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜(UPLC-Q-TOF-MS)儀、單晶X射線衍射(SC-XRD)儀,美國安捷倫科技公司;LabservK3型酶標儀,美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 ω-氨甲基長葉烯的合成

1.2.1中間體N-取代鄰苯二甲酰亞胺衍生物(4)的制備 合成工藝路線如下圖所示:

將化合物3(25.216 g, 0.1 mol)和鄰苯二甲酰亞胺鉀(18.522 g, 0.1 mol)加入到50 mL DMF中,在110 ℃下加熱回流反應2 h。反應結束后,冷卻到室溫,加入50 mL水,抽濾,收集不溶性沉淀物。然后用石油醚洗滌3次,每次20 mL,除去未反應的化合物3,采用減壓過濾收集不溶性沉淀,置于50 ℃下真空干燥3 h得白色粉狀粗產品。將粗產品以乙酸乙酯為溶劑重結晶提純2次,得白色晶體粉末產品,即N-取代鄰苯二甲酰亞胺衍生物(4),化學名為(E)-2-(2-(4,8,8-三甲基十氫-1,4-甲薁-9-亞基)乙基)異吲哚啉-1,3-二酮。以無水乙醇為溶劑,溶劑緩慢揮發法培養得到無色塊狀單晶,進行SC-XRD晶體結構分析。

1.2.2ω-氨甲基長葉烯(5)的制備 在50 mL圓底燒瓶中加入化合物4(2.181 g, 6 mmol)、 80%水合肼(8.635 g, 138 mmol),滴加10%氫氧化鈉水溶液(5 g),在120 ℃下加熱回流反應6 h。反應結束后,待反應混合物冷卻至室溫,用石油醚萃取3次,每次10 mL。將油相合并,用水洗滌3次,每次10 mL,加入無水硫酸鈉干燥過夜,過濾,減壓旋轉蒸發回收溶劑,50 ℃真空干燥得到黃色油狀產物,即得到化合物5。

1.3 分析與表征

1.4 抑菌活性測試

采用96孔板微量肉湯稀釋法[15-16]測定化合物的最小抑菌質量濃度(MIC)。首先,分別將細菌和真菌的菌種在水解酪蛋白瓊脂(MHA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)的平板中培養24 h。之后挑選單菌落分別放置于滅菌水中制成麥氏濁度0.5的菌懸液,再用水解酪蛋白肉湯(MHB)和馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)稀釋制備成用于檢測抑菌活性的含菌1×105CFU/mL的菌懸液;并用含有2% DMSO的MHB和PDB培養基,配置成質量濃度為1 000 mg/L的待稀釋的樣品溶液。

采用二倍稀釋法,用無菌移液槍向無菌96孔板的1號孔和2號孔加注100 μL樣品溶液,2～12號孔加注100 μL無菌MHB或PDB培養基,再從2號孔中取出混勻的100 μL樣品溶液于3號孔中,同法依次稀釋配制供試樣品溶液。然后,向所有供試樣品溶液加注100 μL含菌為1×105CFU/mL的菌懸液,最終供試樣品溶液的質量濃度依次為500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.62、 7.81、 3.91、 1.95、 0.98、 0.49和0.24 mg/L。每種質量濃度供試樣品溶液均平行重復3次,每塊96孔板做1組陽性對照和空白對照,其中利福平、酮康唑分別作為細菌、真菌陽性對照品,不含供試化合物的樣品溶液作為空白對照。最后將含細菌的96孔板置于37 ℃培養箱培養24 h,含真菌的96孔板置于30 ℃培養箱中培養24 h,取出用酶標儀于630 nm波長下測出每孔的光密度(OD)值,按下式計算抑制率:

I=(A2-A1)/A2×100%

式中:I—待測樣品對細菌或真菌生長的抑制率,%;A2—空白對照組OD值;A1—實驗組OD值。

2 結果與討論

2.1 合成工藝的選擇

2.1.1化合物4的合成 N-取代鄰苯二甲酰亞胺衍生物是Gabriel伯胺合成中間體,可由鹵代烴和鄰苯二甲酰亞胺鉀制備。在分子結構上,化合物3可看作是含長葉烯結構的烯丙基氯,化學活性高,理論上容易與鄰苯二甲酰亞胺鉀發生取代反應,生成化合物4。然而,化合物3不溶于水,難以直接與親水性的鄰苯二甲酰亞胺鉀在水、乙醇、丙酮等常規溶劑體系中進行充分反應。實驗發現,以非質子極性的DMF為溶劑,取代反應能順利進行,其中化合物3、鄰苯二甲酰亞胺鉀和目標產物4均可在DMF中溶解或分散,而副產物KCl不溶于DMF、以沉淀形式析出;提高反應溫度、增加攪拌速度,可減緩或消除不溶性沉淀KCl對反應的影響,從而加速取代反應的進行,尤以加熱回流攪拌條件最優。另外,反應結束后,利用未反應原料、目標產物、副產物和DMF在不同溶劑中溶解度的差異,分別以水、非極性溶劑石油醚為溶劑除去未反應原料及副產物KCl,化合物4不溶于水和石油醚,通過減壓過濾收集,再以無水乙醇重結晶提純。

2.1.2水解反應工藝的選擇 N-取代鄰苯二甲酰亞胺衍生物的水解反應是Gabriel伯胺合成的重要步驟,水解反應方法分為酸解、堿解和肼解。實驗發現,在酸性或堿性溶液中,中間化合物4的水解反應較困難,產率低于50%,產物分離工序復雜;而在水合肼甲醇或乙醇溶液中水解反應能順利進行,產率高于酸解或堿解,但產率仍低于75%。究其原因,可能是化合物4的空間位阻較大,不利于H+或OH-的進攻,而且副產物鄰苯二甲酰肼中2個羰基對N原子均存在吸電子的-C效應,使N上電子云密度大大降低,與N原子相連的H原子表現出微弱酸性,可與產物伯胺結合為鹽類復合物[17-18]。另外,溶劑甲醇或乙醇的存在,加熱回流反應體系的溫度通常低于90 ℃,肼解反應受限、效率低。

為此,本研究嘗試采用無溶劑肼解反應體系,以提高回流反應溫度,通過加入少量NaOH溶液,使反應平衡向產物方向移動,從而強化肼解反應效率。因此在1.2.2節的反應條件下,不添加NaOH時,化合物5的產率為70.2%,而添加5 g 10% NaOH溶液后,化合物5的產率可達94.1%。結果表明:化合物5的產率明顯提高,在反應結束混合物冷卻后,能直接以石油醚為溶劑,通過萃取分離得到純度高達98%(GC純度)的產品。

2.2 不同條件對水解反應的影響

2.2.1反應溫度 在與1.2.2節相同的反應物料比、NaOH溶液用量、反應時間條件下,考察反應溫度對化合物5產率的影響,結果見圖1(a)。由圖可知,隨著溫度的升高,產率呈先增加后降低的趨勢。其原因可能是反應溫度低于120 ℃ 時,反應物未能充分活化,反應較緩慢且反應不完全,產率較低;溫度升至120 ℃,剛好為水合肼的沸點,反應體系處于平穩的回流加熱狀態,反應混合物中水合肼的濃度變化不大,反應速度快,產率較高;溫度高于120 ℃ 時,水合肼的蒸發量增加,反應混合物中水合肼濃度降低,反應速度減慢,產率降低。因此,適宜的反應溫度為120 ℃,在此溫度下化合物5產率為94.1%。

a.反應溫度temperature; b.反應時間time; c.n(水合肼)∶n(化合物4) n(hydrazine hydrate)∶n(compound 4)圖1 反應工藝條件對化合物5產率的影響Fig.1 The effect of reaction conditions on the yield of compound 5

2.2.2反應時間 在反應溫度120 ℃、反應物料投加量與1.2.2節相同的條件下,考察反應時間對化合物5產率的影響,結果見圖1(b)。由圖可知,反應時間對產率有較大的影響。反應時間低于6 h時,原料反應不完全,產率較低;反應時間高于6 h時,產率隨著時間的延長而逐漸降低,反應時間越長,加劇了副反應發生。因此,反應時間選擇6 h為宜,此時化合物5的產率為94.1%。

2.2.3反應物料比 在化合物4投加量2.181 g(6 mmol)、 10%NaOH溶液5 g、反應溫度120 ℃和反應時間6 h的條件下,考察了反應物料比n(水合肼)∶n(化合物4)對化合物5產率的影響,結果見圖1(c)。由圖可知,當水合肼用量較少(低于60 mmol)時,反應結束冷卻后,反應混合物凝結為固體,產物較難分離,產率較低;隨著水合肼用量的增加,產率逐漸提高,當水合肼的用量增加至120、 138 mmol時,產率分別達到92.6%、 94.1%,繼續增加水合肼的用量,產率緩慢增加但變化不大,如當水合肼用量為180 mmol時,產率提高至96.2%。綜合考慮,較佳的反應物料比n(水合肼)∶n(化合物4)為23∶1,此時化合物5的產率為94.1%,純度為99.98%。

2.3 化合物結構表征

2.3.1化合物4

2.3.1.2晶體結構解析 采用SC-XRD測定化合物4的晶體結構,分子晶體結構和晶胞堆積圖如圖2所示。

圖2 化合物4的分子晶體結構(a)和堆積透視圖(b)Fig.2 The molecular crystal structure(a) and stacking perspective(b) of compound 4

化合物4晶體(CCDC 2205004) 呈單斜晶系,C2空間群;晶胞參數為a=1.577 5(1) nm,b=0.752 74(9) nm,c=3.344 0(2) nm,α=90°,β=92.834(7)°,γ=90°,V=3.966 0(6) nm3,Mr=363.48,Dc=1.217 mg/m3,Z=8,μ=0.076 mm-1,F(000)=1 568?？梢钥闯?化合物4晶體為雙分子結構,即每個不對稱單元有2個晶體學上獨立的分子,每個分子含有1個鄰苯二酰亞胺結構和1個ω-甲基長葉烯結構,這2個結構通過N(1)原子和C(9)原子或N(1A)和C(9A)原子連接。N(1)—C(9)的鍵長為0.146 9(5) nm,N(1A)—C(9A)的鍵長為0.146 3(4) nm,其它主要鍵長和鍵角見表1和表2。

表1 化合物4中主要鍵的鍵長Table 1 The bond lengths of the main bonds in compound 4

表2 化合物4中主要鍵的鍵角Table 2 The bond angles of the main bonds in compound 4

從晶胞堆積圖(圖2(b))可以看出,化合物4分子間存在4種錯位面對面堆積方式的π-π相互作用[19-20],分別為Cg(4)…Cg(11)(橙色細虛線)、Cg(1)…Cg(14)(石灰綠色細虛線)、Cg(14)…Cg(4)(天藍色細虛線)和Cg(4)…Cg(14)(粉色細虛線),π-π堆積的參數列于表3。前2種存在于苯環與吡咯環之間,對于Cg(4)…Cg(11),質心距離為0.351 3(3) nm,二面角為0.3(3)°,最短垂直距離為0.341 3(2) nm;對于Cg(1)…Cg(14),質心距離為0.353 0(3) nm,二面角為1.6(3)°,最短垂直距離為0.341 7(2) nm。后2種存在于苯環與苯環之間,它們的二面角均為0.8(3)°,但質心距離不同;對于Cg(14)…Cg(4),其質心距離為0.371 8(3) nm,最短的垂直距離為0.341 5(2) nm;而對于Cg(4)… Cg(14),其質心距離為0.395 4(3) nm,最短垂直距離為0.347 0(2) nm。

表3 晶體的π-π相互作用Table 3 The π-π interactions of the crystal

化合物5是化合物4的肼解反應產物,反應前后分子構型保持不變,其分子結構可從化合物4的分子晶體結構推斷,絕對構型如圖3所示,按IUPAC命名法,其化學名稱為(E)-2-(4,8,8-三甲基十氫-1,4-甲薁-9-亞基)乙基-1-胺。

圖3 化合物5的絕對構型Fig.3 The absolute configuration of compound 5

2.4 抑菌活性分析

化合物1～5的抑菌活性測定結果見表4。

由表4可知,化合物5能抑制細菌和真菌的生長,表現出較高的抑菌活性,其對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌和黑曲霉的MIC值分別為1.95、 1.95、 7.81、 3.91、 3.91、 1.95和15.63 mg/L?；衔?對所有測試細菌和真菌的抑菌活性明顯高于長葉烯(1)和化合物2～4,說明長葉烯結構和烯丙胺功能基團具有協同增強抑菌作用,伯胺官能團的引入使化合物5具有親水親油性,表現出較高的抑菌活性。與陽性對照品相比,化合物5對細菌的MIC值等于或高于利福平,即抑菌活性稍弱于利福平,而對2種真菌白色念珠菌和熱帶念珠菌的MIC值低于酮康唑,即抑菌活性高于酮康唑,其中原因尚不清楚?；衔?具有化學活性的伯胺功能基團,本課題組后續擬繼續開展化合物5衍生物的合成及生物活性研究,進一步揭示其原理及作用機制。

3 結 論

3.1采用改進的Gabriel伯胺合成法,由ω-氯甲基長葉烯(3)經中間化合物4進一步合成了ω-氨甲基長葉烯(5),產物分子結構經FT-IR、1H NMR、13C NMR、HRMS和SC-XRD進行表征確認。單因素試驗結果表明:采用無溶劑回流加熱水合肼水解反應工藝,添加少量NaOH溶液,能促進水解反應的進行,在簡化產物分離純化工藝的同時提高產率。較佳的水解反應工藝條件為:n(水合肼)∶n(化合物4)為23∶1、 10%氫氧化鈉溶液5 g、反應溫度120 ℃、反應時間6 h,此條件下化合物5的產率高達94.1%,純度為99.98%。

3.2抑菌活性實驗結果表明:化合物5對2種革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)、 2種革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、肺炎克雷伯菌)和3種真菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌、黑曲霉)的生長均具有明顯的抑制作用,其MIC值分別為1.95、 1.95、 7.81、 3.91、 3.91、 1.95和15.63 mg/L,其對2種真菌白色念珠菌和熱帶念珠菌的抑制活性高于陽性對照品酮康唑?；衔?具有化學活性和抑菌活性的烯丙胺功能基團,有望通過進一步衍生化合成系列衍生物,提高抑菌等生物活性,進一步拓展長葉烯的應用領域。