雞乳酸脫氫酶A 基因突變對DF-1 細胞能量代謝和法氏囊病毒增殖的影響

李祥超， 易小萍

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室, 上海 200237）

DF-1 細胞來源于ELL-0（East Lansing Line）雞胚胎，是Chicken Embryo Fibroblast（CEF）永生化的細胞系，可無限繁殖，因此具備比CEF 更大的增殖能力[1]。該細胞缺少禽白血病病毒、肉瘤病毒群病毒相關的內源片段，支持禽反轉錄病毒的復制，已被廣泛應用于禽類病毒的增殖和疫苗的生產，例如馬立克病毒[2]、禽 流 感 病 毒[3-4]、Infectious Bursal Disease Virus[5-6]（IBDV）等。但DF-1 細胞的IBDV 生產能力較低，因此有效提高DF-1 細胞的IBDV 增殖能力具有重要的研究價值。

許多體外培養的哺乳動物細胞系表現出類似Warburg 效應的表型，具有增強的糖酵解通量和高乳酸積累，正如Otto Warburg 描述的癌細胞，這種表型通常不是歸因于低氧環境，而是細胞誘導或自發形成以及對體外培養的適應[7]。體外培養動物細胞中的丙酮酸有很大一部分在乳酸脫氫酶的催化下還原為乳酸，一些哺乳動物細胞系中葡萄糖轉化為乳酸的比率高達90%[8]。這種糖酵解方式會導致乳酸的積累，最終導致培養基的酸化，從而抑制細胞的快速生長。以病毒為最終產物的細胞培養過程中，病毒的增殖依賴于宿主細胞的物質和能量代謝，在病毒快速增殖的中后期細胞糖酵解速率下降，無法及時提供病毒大量增殖所需能量，從而限制病毒增殖[9-10]。乳酸主要是通過乳酸脫氫酶A 將葡萄糖代謝產生的丙酮酸轉化而來，減少乳酸積累的常用手段是敲除或者下調乳酸脫氫酶A，這種方法能夠有效減少乳酸生成，同時不損害細胞活力或生產力。

由于生物技術的快速發展，基因編輯技術CRISPR/Cas9 系統可實現對動物細胞的靶向基因快速穩定的突變。目前CRISPR/Cas9 系統已經廣泛應用于病毒、細菌、酵母、霉菌[11]、植物、昆蟲、鼠、魚和人種屬細胞中?；陔u體細胞在遺傳發育研究上的重要作用，Véron 等[12]首先將CRISPR/Cas9 系統應用于雞細胞，通過CRISPR 突變Pax7基因研究動物模型中調控發育的分子機制。Abu-Bonsrah 等[13]則使用CRISPR/Cas9 系統敲除了DF-1 細胞和DT40 細胞中的6 個遺傳相關基因，該研究證明利用CRISPR/Cas9 系統可對雞細胞基因組進行精確的靶向遺傳操作，并證明CRISPR/Cas9 系統在雞細胞上的操作可行性和高效性。

本研究首先在人CRISPR 載體基礎上對啟動子進行優化，建立適用于DF-1 細胞的CRISPR 載體，隨后應用該系統對DF-1 細胞的雞乳酸脫氫酶（GgLDHA）基因進行定向突變，獲得多株不同基因突變型的單克隆細胞株，并對這些重組細胞株的基因型、蛋白表達和乳酸脫氧酶（LDH）酶活進行分析驗證；同時進一步對突變細胞株的生長、葡萄糖和乳酸代謝、能量代謝以及IBDV 增殖進行綜合分析，系統研究GgLDHA基因突變對DF-1 細胞能量代謝以及IBDV增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 LDH 同工酶分離和鑒定

（1）破碎細胞：取適量細胞重懸于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，將其置于冰上用超聲破碎細胞。細胞破碎后，將樣品液在4 ℃下13 000 r/min 離心10 min，取上清保存待用。（2）蛋白濃度測定：以牛血清白蛋白為對照，測定樣品上清中的蛋白濃度（PierceTMBCA 蛋白測定試劑盒，Thermo Scientific）。（3）電泳和同工酶顯色：制備7.5%（75 g/L，下同）非變性PAGE凝膠，預電泳20 min；每孔上樣15 μg 總蛋白，在Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.9）體系中電泳，后對LDH 同工酶進行活性顯色，最后加入脫色液終止酶反應。

1.2 GgLDHA 基因突變的DF-1 細胞株構建

1.2.1 靶向GgLDHA基因的px458-sgRNA 設計和構建 靶向GgLDHA基因的sgRNA 通過在線設計工具（Optimized CRISPR Design 和CRISPR direct）設計得到，篩選出評分較高的sgRNAs，其相關引物序列見表1 所示。sgRNA 構建參考Ran 等[14]的方法構建，其中引物（5’-TTCGCCACCTCTGACTTGA-3’）用于sgRNA 測序分析。所有引物合成和測序工作由生工生物工程公司完成，px458 質粒購自Addgene 庫。

表1 靶向GgLDHA 基因的sgRNA 構建的引物序列Table 1 Primer sequences in the sgRNA construction targeting toGgLDHA gene

1.3 Western Blot 檢測

用RIPA（Beyotime）裂解液提取DF-1 野生型細胞和各個突變型單克隆細胞的蛋白，使用PierceTMBCA 蛋白測定試劑盒檢測其總蛋白濃度。提取的每一蛋白樣品經7.5%的SDS-PAGE 電泳，電泳后的蛋白被轉移到硝化纖維素膜上。轉移的蛋白在QuickBlockTMWestern Blot 阻斷緩沖液（Beyotime）阻斷后，先后用抗LDH 抗體和辣根過氧化酶（HRP）偶聯的羊抗兔免疫球蛋白（Goat anti-rabbit IgG）抗體孵育，其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）用作內參蛋白。所有抗體均購自Abcam 公司。

1.4 LDH 酶活測定

樣品上清的總LDH 酶活測定按照LDH 活性檢測試劑盒（Sigma-Aldrich）的操作步驟進行：收集樣品上清，在4 ℃、12 000g條件下離心15 min，加入試劑盒的工作溶液后，在450 nm 處讀取樣品的吸光度，以相對野生型細胞的百分數表示結果。

1.5 DF-1 細胞生長、葡萄糖和乳酸代謝以及能量代謝分析

1.5.1 DF-1 細胞生長 本文所用DF-1 細胞來自于本實驗室保存。將DF-1 細胞以每毫升3×105個細胞的密度接種于T25 方瓶中，置于培養箱（37 ℃，φ=5%CO2，70%濕度）中培養。細胞培養所用的培養基為含φ=5% 胎 牛 血 清（FBS）的DMEM/F12（培 養基DMEM 與F12 的體積比為1∶1，下同），培養體積為5 mL?；罴毎芏群图毎盥什捎醚蛴嫈蛋逵嬎?。當細胞匯合度達到90% 時，以每毫升6×105個活細胞密度進行細胞接種培養，每24 h 取樣一次，采用血球計數板分別計算每一時間點的活細胞密度，用于繪制細胞生長曲線。每個樣品重復3 個平行實驗。同時收集細胞培養上清，用于檢測葡萄糖和乳酸含量。

1.5.2 葡萄糖和乳酸含量測定 將上述所得的細胞培養上清，采用生物傳感分析儀（濟南延和生物科技有限公司）測定其葡萄糖和乳酸濃度，用于計算葡萄糖消耗速率（GCR）和乳酸生成速率（LPR）。

1.5.3 線粒體呼吸測定 細胞的線粒體呼吸采用Oxygraph-2k 呼吸檢測儀（OROBOROS 公司）測定，操作步驟參考Zhao 等[15]描述：將野生型和突變型單克隆細胞正常傳代，48 h 后重懸細胞至DMEM/F12培養基中，根據細胞計數結果將細胞稀釋至每毫升1.0×106個細胞；然后加入至Oxygraph-2k 呼吸檢測儀的測定倉中，封閉倉后測定細胞的基礎氧呼吸速率ROUTINE；加入1 μL（2 μg/mL）寡霉素，記錄此時氧氣消耗速率LEAK；然后逐步加入羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）解偶聯劑，氧氣消耗速率逐漸升高至平穩，記錄此時氧氣消耗速率（ETS）；最后加入抗霉素A 和魚藤酮（Sigma 公司）來抑制電子傳遞鏈的復合物I 和III，氧氣消耗速率會急劇下降至平穩，記錄為ROX。

1.5.4 腺苷三磷酸（ATP）濃度測定 ATP 胞內濃度測定采用的是ADP/ATP 比率檢測試劑盒（Sigma 公司）。本實驗將對照細胞株的胞內ATP 水平設置為100%，由此計算得到各克隆細胞株的胞內總ATP 相對含量。

1.5.5 IBDV 滴度測定 當培養的DF-1 細胞匯合度達到90% 時，移除培養上清，加入新鮮DMEM/F12培養基，接種IBDV 病毒。當80% 左右的細胞發生病變后，結束細胞培養，反復凍融3 次，收獲病毒。IBDV 病毒滴度（TCID50）參照Chen 等[16]描述：將待檢測病毒樣品進行梯度稀釋（10-1～10-10），然后將每一稀釋樣品接種于96 孔板的DF-1 單層細胞中，每一梯度的病毒稀釋液接種6 個復孔。在顯微鏡下觀察細胞病變效應（CPE），其特征為細胞變圓、脫落和裂解，并使用Reed-Muench 法計算TCID50。

2 結果與討論

2.1 LDH 同工酶鑒定和GgLDHA 基因型確認

LDH 是催化丙酮酸與乳酸相互轉變的同工酶，不同類型的同工酶是由A 或B 亞基組成的四聚體，具有不同的相對分子量，通過PAGE 電泳方法可以將其分離，DF-1 細胞株的LDH 同工酶的表達分析如圖1 所示。從圖1 可以看出，LDH5 顯色較深，而LDH5 由4 個LDHA 亞基組成，推測在DF-1 細胞中LDHA 表達占據主導地位。因此，本研究選擇GgLDHA基因作為靶向基因對其進行基因突變。對本研究采用的野生型DF-1 細胞中的GgLDHA基因序列進行測序確認（NCBI Reference Sequence：NC_006092.3）。測序結果表明，GgLDHA基因的部分序列大小1 076 bp（含部分內含子、外顯子exon 4 和exon 5）， 與NC_006092.3 存在7 個堿基的差別，同源性為99.3%?；诨驕y序結果，針對設計靶向GgLDHA基因的sgRNA 設計具體見表1 所示。

圖1 DF-1 細胞株的LDH 同工酶表達分析Fig.1 LDH isoenzyme expression in DF-1 cell

2.2 CRISPR 載體優化、靶向GgLDHA 的sgRNA構建及活性驗證

將px458 質粒直接轉染DF-1 細胞，在熒光顯微鏡下未觀察到任何綠色熒光蛋白（GFP）陽性細胞。推測px458 質粒載體中巨細胞病毒重組啟動子（CBh）在雞胚細胞中未能有效啟動Cas9蛋白表達，而Cas9 蛋白的表達對于CRISPR系統發揮基因編輯是必須要素。因此，將CBh 啟動子更換為更通用的巨細胞病毒（CMV）啟動子，并將px458 質粒載體中的人U6 啟動子（huU6）更換為雞U6（chU6）啟動子，具體過程如圖2（a～c）所示。CMV序列和chU6 都通過PCR擴增得到，其中CMV序列是以pCI-neo 為擴增模板和同CMV 配對的引物對擴增所得。將px458 質粒載體和CMV 的PCR 片段同時用KpnI 和AgeI 內切酶處理，然后用T4 連接酶連接獲得px458-CMV 載體。采用CMV 啟動子替換CBh 啟動子后，GFP 蛋白在DF-1 細胞中獲得正常表達如圖2（d）所示。由于Cas9 蛋白與GFP蛋白通過2A 肽（T2A）共用CMV 啟動子，所以GFP 蛋白的高表達間接表征Cas9 蛋白在DF-1 細胞中獲得了高表達。

圖2 適用于DF-1 細胞的CRISPR 載體構建過程和DF-1 細胞中Cas9 蛋白表達驗證Fig.2 Processes of CRISPR vector construction suitable for DF-1 cell and Cas9 protein expression verification in DF-1 cell

II 型CRISPR 系統中采用人III 型RNA 聚合酶U6 啟動子起始sgRNA 轉錄，考慮到huU6 和chU6啟動子的種屬差異性，且Gandhi 等[17]的研究中發現chU6 啟動子能夠獲得比huU6 啟動子高4 倍的sgRNA 表達，因此本研究嘗試采用chU6 啟動子替換huU6 啟動子，結果表明（圖2（e）），在DF-1 細胞中，huU6 和chU6 啟動子具有相似的活性，推測chU6 啟動子可能存在DF-1 細胞不具備的調控因子。通過T7EI 錯配識別酶的切割作用，對sgRNA 活性進行評價。研究發現，單條sgRNA 轉染的Indel% 很低，通過共轉染sgRNA1 和sgRNA2，可將Indel% 顯著提高，相較單一sgRNA 轉染分別提高了2 倍和4 倍。

2.3 GgLDHA 基因突變的DF-1 單克隆細胞株鑒定

通過轉染重組CRISPR 載體，結合流式細胞儀分選，共獲得13 株GgLDHA基因突變的單克隆DF-1 細胞株，分別標記為MC1～MC13，基因突變株的基因型、蛋白表達和酶活分析如圖3 所示。對突變序列進行基因測序鑒定發現（圖3（b）），基因突變大多發生于雙鏈斷裂（DSB）附近，且造成中間29 bp 片段的刪除。從13 株突變型細胞株基因型分析發現，既存在GgLDHA基因的純合突變，也存在如MC1、MC10、MC11 的嵌合突變，存在一定的隨機性。因突變發生于exon 5 編碼區（圖3（a），PAM 為原間隔相鄰基序），且插入或刪除的堿基數不是3 的倍數，因此預測基因大多發生了移碼突變。值得注意的是，由于MC1 突變株發生嵌合GgLDHA基因突變，加上比其他克隆更高的Western Blot 印跡表達，因此未對其檢測LDH 酶活性。MC4 和MC6 突變株后期生長不佳，推測可能發生脫靶，影響了細胞生長，未能獲得蛋白和酶活數據。

圖3 GgLDHA 基因突變克隆株的基因型、蛋白表達和酶活分析Fig.3 GgLDHA mutation monoclonal genotype, protein expression and LDH activity

通過Western Blot 進一步驗證基因突變對LDHA蛋白表達的影響，從圖3（c）可以看出，突變細胞株的LDHA 相對表達水平出現不同程度的降低。其中MC5 的LDHA 相對表達水平只有對照細胞的14%，MC2、MC8、MC9、MC11、MC12、MC13 的LDHA 相對表達水平約為對照細胞的30%～60%。綜合分析表明，不同突變形式和位置對LDHA 蛋白表達可產生不同的影響，雙鏈DNA 中不是3 倍數的堿基數的片段缺失，可造成蛋白表達水平顯著下降。

LDHA 作為LDH 的重要組成亞基，基因突變會直接減弱LDH 總酶活。將對照細胞中LDH 總相對酶活標記為100%，LDH 總酶活的測定結果（圖3（d））顯示，相比于對照細胞，幾乎所有的突變細胞株LDH 總酶活均顯著下降，只有對照細胞株的10%～20%。LDH 酶活結果與LDHA 蛋白表達，呈現不完全相同的趨勢，推測可能突變部位選擇的是LDHA 酶關鍵活性區域，突變對酶活影響顯著。上述研究結果表明對GgLDHA基因進行定向突變，可顯著降低DF-1 細胞的LDH 總酶活性。

2.4 GgLDHA 基因突變對DF-1 細胞生長、葡萄糖和乳酸代謝的影響

為評價GgLDHA基因突變對DF-1 細胞生長和代謝的影響，本文選取2 株突變型單克隆細胞株（MC2 和MC5）進行細胞生長、葡萄糖和乳酸代謝的探討，結果如圖4 所示。由圖可見，相比于對照細胞，GgLDHA基因突變對DF-1 細胞生長無明顯的影響，但整個培養過程（96 h）的平均GCR 明顯下降（圖4（b）），平均LPR 也顯著降低（圖4（c））。相比于對照細胞，突變株MC2、MC5 的平均GCR 分別下降13%和23%；平均LPR 則分別下降了24%和41%。凈乳酸的產量與凈葡萄糖的消耗量之比（LPR/GCR）比值可以表征葡萄糖進入乳酸生成途徑的通量，從圖4（d）可以發現，對照細胞LPR/GCR 達到了2.1，而突變株該比值明顯降低，MC5 最低降至1.6，降低了24%。表明GgLDHA突變能在不影響細胞生長的前提下，有效降低乳酸生成速率。

圖4 野生型和突變型DF-1 細胞株的細胞生長、葡萄糖和乳酸代謝對比Fig.4 Comparison of cell growth, glucose and lactic acid metabolism between wild type and mutant DF-1 cells

2.5 GgLDHA 基因突變對DF-1 細胞能量代謝、IBDX病毒增殖的影響

為評估GgLDHA基因突變對DF-1 細胞有氧代謝速率和能量代謝效率的影響，本文采用線粒體呼吸測定儀測定氧呼吸速率，結果如圖5 所示。由圖可見，相比于對照細胞，兩株突變細胞株的R/E 都有所增加，凈呼吸比值（Net R/E）也明顯增加，表明在突變細胞株中更多比例的氧氣用于ATP 合成，突變細胞株的有氧呼吸速率明顯加強。

圖5 野生型和突變型DF-1 細胞株的的能量代謝和IBDV 病毒滴度Fig.5 Cell energy metabolism and IBDV titer of wild type and mutant DF-1 cells

胞內總ATP 濃度可以用來表征細胞的能量狀態，為進一步探索GgLDHA基因突變對DF-1 細胞能量代謝的影響，對比野生型和突變株的胞內總ATP水平，結果如圖5（b）所示，設對照細胞中胞內ATP濃度為100%，突變細胞株的胞內ATP 濃度明顯提高，其中MC5 突變細胞株的胞內ATP 濃度增加了57%，表明在丙酮酸生成乳酸通量減少的同時，進入三羧酸（TCA）循環的通量增加，產生了更多的ATP，突變細胞株的能量代謝效率明顯改善。結合代謝分析中突變細胞株葡萄糖消耗速率的明顯下降，表明突變細胞株的葡萄糖利用效率得到明顯提高。

DF-1 細胞是IBDV 的良好宿主細胞，IBDV 病毒的復制、增殖嚴格依賴于宿主細胞為其提供物質和能量。對照細胞的相對IBDV 滴度為1，與對照細胞相比，突變細胞株MC2 和MC5 的相對IBDV 滴度分別提高了2 倍和5 倍（見圖5（c））。突變細胞株的IBDV 滴度顯著增加，突變細胞株的IBDV 增殖能力明顯增強。表明DF-1 細胞能量代謝狀態的改善有效促進了IBDV增殖。

3 結 論

本研究采用CRISPR/Cas9 系統對DF-1 細胞的GgLDHA基因進行了定向突變。首先對原適用于人的CRISPR 載體px458 進行了改造，用CMV 啟動子替換CBh 啟動子，同時用chU6 啟動子替換huU6 啟動子，最終獲得了能夠適用于DF-1 細胞的CRISPR載體px458-chU6-CMV。采取共轉靶向同一基因的2 條sgRNA，通過造成中間大片段的刪除，有效提高了Indel%?；蜩b定結果顯示，多株突變細胞中GgLDHA基因發生29 bp 的刪除，這有可能是共轉靶向GgLDHA基因的2 條sgRNA 靶向位置相距適中，可以為Cas9 蛋白造成DSB 提供空間位阻，從而造成中間大片段的刪除?；蛐丸b定結果表明大部分突變型細胞株的GgLDHA基因突變發生于sgRNA1 和sgRNA2 引起的DSB 處，但也存在例外，如MC3 細胞株的一條染色體GgLDHA基因型發生2 bp 的插入和10 bp 的刪除，而另外一條染色體的等位基因處發生1 bp 的插入和14 bp 的刪除。MC13細胞株的一條染色體中GgLDHA基因發生55 bp 的刪除，而另外一條染色體的等位點發生1 bp 的插入和1 bp 的刪除。綜合分析基因型鑒定結果表明，CRISPR/Cas9 系統實施的靶向基因突變存在部分隨機性，移碼突變是造成靶向蛋白LDHA 酶活下降的主要原因。采取共轉靶向同一基因2 條sgRNA 的方法，能夠有效獲得大片段移碼突變。

在DF-1 細胞中，乳酸代謝與細胞的能量代謝密切相關。本文中在野生型DF-1 細胞快速生長階段（0～96 h），其乳酸分泌速率高達約8.2 μmol/(106cell·d)，而葡萄糖消耗速率約為3.9 μmol/(106cell·d)，乳酸對葡萄糖的得率為2.1，表明在野生型DF-1 細胞中絕大部分葡萄糖進入了乳酸生成的代謝途徑。在氧化磷酸化過程中，每分子葡萄糖能夠獲得36 個ATP，而在糖酵解過程中，每分子葡萄糖只能獲得2 個ATP，是一種較為低效的能量代謝過程。顯然，野生型DF-1細胞更傾向于采用糖酵解這種低效但快速產能的代謝方式，可為DF-1 細胞的病毒增殖提供有效的能量補充。Xie 等[18]通過多基因來調控丙酮酸相關代謝，通過減少丙酮酸到乳酸的通量，增加丙酮酸進入TCA 循環的通量，有效提高了HEK 293 細胞的腺病毒產量。

GgLDHA基因的突變對DF-1 細胞生長無明顯影響，卻能夠改善葡萄糖的利用效率。有研究[19]證明LDHA 和LDHB 基因丟失，不會損害細胞生長而且還會促進線粒體能量代謝。然而，乳酸代謝使得細胞的體外培養通過糖酵解能夠自給自足，煙酰胺腺嘌呤是維持糖酵解運行的關鍵物質，其在丙酮酸轉化為乳酸的過程中生成，所以葡萄糖供給充足時，糖酵解就由細胞快速完成產能。TCA 循環和氧化磷酸化涉及眾多酶和底物，制約因素較多，糖酵解的獨立性擺脫了后續眾多因素的制約，保障了細胞能量供給的穩定性和安全性。與氧化磷酸化相比，雖然糖酵解產生ATP 效率低，但速率得到提升，單位時間內產能增加，當糖酵解快速進行時，其ATP 產量很容易超越氧化磷酸化，Pfeiffer 等[20]認為這種低效高產的能量形成方式在能量競爭中更具有生長優勢。這種能量代謝模式在細胞快速生長時保證了快速和穩定的能量供應，然而在病毒增殖期，葡萄糖的這種代謝模式明顯下降，不能及時供給病毒大量增殖所需的能量需求。本文發現在DF-1 細胞中，GgLDHA基因突變可在不影響DF-1 細胞生長的情況下明顯改善DF-1 細胞代謝狀態，促進葡萄糖的利用效率。突變細胞株MC2 乳酸分泌速率降至6.3 μmol/(106cell·d)，而葡萄糖消耗速率約為3.4 μmol/(106cell·d)，乳酸對葡萄糖的得率降為1.8，乳酸的分泌速率和乳酸對葡萄糖的得率都得到明顯改善；而MC5 的乳酸分泌速率則進一步降低至4.8 μmol/(106cell·d)，葡萄糖消耗速率也降低至3.0 μmol/(106cell·d)，乳酸對葡萄糖的得率進一步降為1.6，其對葡萄糖利用效果的改善更為明顯。

病毒復制需要來源于宿主細胞提供能量和大分子前體。Munger 等[21]采用HCMV 病毒感染人成纖維細胞，發現細胞的糖酵解和TCA 循環的代謝物水平增加，同時相關酶的轉錄水平也發生了上調，這兩個代謝途徑不僅能夠提供多種大分子代謝物的合成前體，同時也提供能量，說明病毒的增殖與細胞的能量狀態密切相關。DF-1細胞作為IBDV 的宿主細胞，IBDV 增殖嚴格依賴于宿主細胞的物質和能量代謝。為了深入探索GgLDHA基因突變對DF-1 細胞有氧代謝速率的影響，本文探討了GgLDHA基因突變對DF-1 細胞有氧呼吸代謝和能量代謝的影響。研究發現，相比于對照細胞株，突變細胞株的R/E、Net R/E 均有所增加，顯示更多比例的氧氣用于后續ATP 的合成。進一步分析胞內ATP 濃度表明，相比于對照細胞，MC5 和MC2 突變細胞株的胞內ATP 濃度較對照細胞分別增加了57%和40%，推測葡萄糖酵解生成的丙酮酸更多進入TCA 循環中生成乙酰，通過有氧代謝產生更多的ATP，有效提高了能量代謝效率。突變株和對照細胞株的IBDV 病毒感染研究表明，MC2 和MC5 突變細胞株的IBDV 增殖能力明顯增強，病毒滴度較對照細胞顯著增加，相比于對照細胞株，MC5 和MC2 突變細胞株的相對病毒滴度分別提高了5 倍和2 倍。由以上可見，促進DF-1 細胞的能量代謝，有利于促進IBDV 在DF-1 中的增殖。

總之，針對DF-1 細胞，本研究重新優化構建了適用于DF-1 細胞的CRISPR 載體，發現chU6 和huU6啟動子具有相似的活性，CMV 啟動子和Cas9 蛋白在DF-1 細胞中具有良好的轉錄和表達活性。同時還發現共轉染2 條sgRNA 的方法，可以顯著提高Indel%。采用優化的CRISPR 載體成功獲得了13 株GgLDHA基因突變型單克隆細胞株，對突變株細胞生長、物質、能量代謝以及病毒增殖綜合分析表明，發生GgLDHA基因型突變不會影響細胞正常生長，可有效減少乳酸生成，提高葡萄糖的利用效率，明顯改善DF-1 細胞能量代謝效率，顯著提高IBDV 病毒滴度。本研究為提高IBDV 疫苗的生產能力提供了一種新思路。