荔枝中丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈4種農藥殘留的定量檢測方法

韋齡乾，潘喜芳，蔣揚柏，黃全書，盧希源

（欽州市農產品質量安全檢測中心 廣西欽州 535000）

丁蟲腈[1-4]對菜青蟲、小菜蛾、螟蟲、粘蟲、褐飛虱、葉甲等害蟲具有高活性，并有較好的防治效果，在水稻、蔬菜上的應用空間巨大，發展潛力廣闊，目前只發現有在大米和油菜中的農殘檢測方法。

丁香菌酯對瓜果、蔬菜、果樹的霜霉病、晚疫病、黑星病、炭疽病、葉霉病有效，同時對輪紋病、棉花枯萎病、水稻瘟疫病、紋枯病及小麥根腐病、玉米小斑病亦有效，目前未發現有在農作物上的農殘檢測方法。

氯啶菌酯是一種高效、廣譜、低毒殺菌劑，具有預防及治療作用；其殺菌譜廣、活性高、對非標生物及環境相容性好、持效期長、對作物安全等。目前未發現有在農作物上的農殘檢測方法。

乙唑螨腈[5]可有效防治螨卵、幼螨、若螨、成螨，因此發展潛力廣闊，目前只發現此種農藥在枸杞中的農殘檢測方法。

以上4 種農藥均是由我國自主開發研制的農藥，并且已獲得中國專利和PCT 專利，發展潛力廣闊，具有良好的商品化開發前景和競爭優勢，但是目前缺少這4 種農藥在蔬菜、水果上的殘留檢測方法。因此，研究丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈的農殘檢測方法具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品：荔枝（來源于欽州市一荔枝生產綠色防控試驗基地），此處荔枝不噴施任何農藥。

標準物質：丁蟲腈［來源于農業農村部環境保護科研監測所（天津）］，丁香菌酯（來源于上海安譜實驗科技股份有限公司），氯啶菌酯（來源于德國Dr.Ehrenstorfer公司），乙唑螨腈（來源于北京曼哈格生物科技有限公司）。

其他試劑：乙腈（HPLC，Tedia Company），甲醇（HPLC，Tedia Company），乙酸銨(LC-MS 級，CNW Technologies)，無水甲酸（LC-MS級，天津市光復科技發展有限公司），超純水（Millipore 超純水機制備），微孔濾膜（0.22 μm，Agela Technologies）。Quechers 提取包（品牌：艾吉爾。內含4 g 無水硫酸鎂，1 g氯化鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉，1 g檸檬酸鈉）；提取柱（品牌：艾吉爾）。

1.2 主要儀器設備

液相色譜儀串聯三重四極桿質譜(型號：LCMS-8040，島津SHIMADZU公司)，臺式高速離心機（Sigma 3K15曦瑪離心機有限公司），臺式微量離心機(賽默飛世爾科技公司)，電子天平（型號：JJ1000，精確度0.001 g，美國雙杰兄弟有限公司常熟雙杰測試儀器廠），多管渦漩混合儀（AS-02040-00，杭州奧盛儀器有限公司），振蕩器（Ika VXR Basic，德國IKA），移液槍（賽默飛世爾科技公司）。

1.3 試驗方法

目前我國常用的檢測蔬菜、水果中的農藥殘留方法包括國家標準GB/T 20769—2008，NY/T 761—2008、GB/T 23200—113、GB/T 23200—121等，常用的前處理方法有勻漿萃取法、Quechers 處理法[6-9]，定量檢測儀器常用色相、液相色譜儀，氣相液相串聯質譜儀。勻漿萃取法前處理操作繁瑣，費時費力，成本高，不適合大批量樣品的快速定性及定量分析，而Quechers 方法是一種快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全的樣品前處理方法，近年來已廣泛用于食品中農藥殘留量的檢測。因此，本文選擇應用Quechers方法-超高效液相-串聯質譜儀同時檢測蔬菜水果上丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈農藥殘留量。

1.3.1 標準溶液配制

用丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈標準物質，以乙腈為溶劑，配制成濃度為10 u g/mL的混合標準溶液，于-14 ℃避光冷藏儲存備用，以便作為標準曲線溶液配制和添加回收用。本次實驗曲線標點配置0.02、0.04、0.08、0.12、0.24、0.48 u g/mL 等6 個濃度梯度，為檢驗是否受基質效應影響，應用2種不同溶劑配制標準曲線溶液，一是用乙腈作為溶劑配制（溶劑標），二是用樣品前處理后得到的空白基質溶液配制（基質標），最后比較2 種情況下標準曲線的線性范圍、相關系數以及2 條標準曲線定量準確性。

1.3.2 樣品前處理

提?。簻蚀_稱取10.00 g荔枝（勻漿狀）樣品放入50 mL離心管，準確加入10.00 mL乙腈及提取包粉末，并加入一顆陶瓷均質子，于振蕩器劇烈振蕩（2 min以上）后，置于5 000 r/min的離心機中離心5 min。

凈化：準確吸取1 mL 上清液置于內含除水劑和凈化材料的提取柱中（每1 mL提取液使用150 mg無水硫酸鎂，25 mg 乙二胺-N-丙基硅烷），漩渦混勻1 min，5 000 r/min 離心5 min。將上清液通過0.22 μ m微孔濾膜過濾，供LC-MS/MS分析。

1.3.3 添加回收試驗

本文以荔枝為基質，做6個梯度濃度的添加，每個濃度梯度做2個重復，具體如下：

采集4 kg荔枝樣品，去核后用攪拌機搗碎至勻漿狀態，準確稱取13 個（10±0.05 g）荔枝樣品（勻漿狀）于50 mL 離心管中，一個做空白樣CK，其余12個樣品做質控樣品，分別制作0.02、0.04、0.08、0.12、0.24、0.48 mg/kg 6 個濃度的添加回收，編號分別為A、B、C、D、E、F，其中每個添加濃度做2個平行。質控樣添加完成后靜置30 min，待樣品充分吸收標液后，按照樣品前處理（1.3.2）步驟準確操作。將此步驟所得的樣品移到液相色譜儀串聯三重四極桿質譜上進行檢測，每個樣品進樣2次，最后用基質標液曲線和溶劑標液曲線分別定量（外標法）。

1.3.4 色譜-質譜條件

色譜條件：SHIMADZU C18柱子，譜柱（Φ1.9 μ m，2.1 mm×100 mm）；柱溫為常溫；流速0.4 mL/min；進樣量1 μ L；流動相A 為0.5 mmol/L 醋酸銨+0.01%甲酸水溶液，流動相B為甲醇；洗脫方式，有機相初始濃度為20%，5 min有機相濃度為50%，24～26 min設置95%（詳見表1）。

表1 液相色譜中流動相洗脫梯度條件

質譜條件：采用電噴霧離子化模式（ESI）；掃描模式為多反應監測（MRM）；離子源接口電壓，ESI+為+4.5 kV；ESI-為-3.5 kV；霧化氣為氮氣，3 L/min；干燥氣為氮氣15 L/min；碰撞氣為氬氣；DL管溫度為250 ℃；加熱模塊溫度為400 ℃；

對4 種農藥單標溶液進行質譜參數優化，確定特征母離子和子離子，優化后的相關質譜參數見表2。圖1 為丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈TIC離子流圖，從圖像上可看出0.02 u g/mL濃度下丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈相應強度均在3萬以上，氯啶菌酯高達6萬以上，4種農藥在在圖譜中基線平穩，雜峰少，峰型呈正態分布，半峰寬正常。雖然丁蟲腈響應值不到1萬，但從響應值和重現性高等方面看，并不影響定量準確。

圖1 丁蟲腈、氯啶菌酯、丁香菌酯、乙唑螨腈濃度為0.02 u g/mL TIC離子流圖

表2 丁蟲腈、氯啶菌酯、丁香菌酯、乙唑螨腈4種農藥優化的質譜參數

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

在農藥殘留分析中，常用提取溶劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等。本文以荔枝（勻漿狀）樣品為研究對象，考察了4 種提取劑對4 種農藥的提取效果。通過實驗發現：丙酮提取時的分層效果不明顯，鹽析效果不如乙腈；二氯甲烷提取雜質較多，且溶劑極易揮發；乙酸乙酯的回收率雖能滿足要求，但與乙腈相比雜質較多，干擾更大；而乙腈的提取效率高，在去除糖分雜質方面效果較好。綜合考慮，本文選擇乙腈作為提取溶劑最為合適。

2.2 凈化條件的選擇

農殘檢測中常用的固體吸附劑有C18、GCB（石墨化碳黑）和PSA（N-丙基乙二胺）。C18主要用于吸附油脂等弱極性雜質。GCB 雖適用于去除蔬菜中的色素等干擾，但實驗發現待測物損失較多。PSA 能有效去除各種有機酸、色素、脂肪等物質的干擾，可獲得良好回收效果。從節約成本、提高凈化效果的角度綜合考慮，本文采用PSA 做吸附劑。

2.3 質標和溶劑標兩條標準曲線的線性范圍、相關系數、標準曲線圖

本實驗通過準確配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.24 u g/mL 和0.48 u g/mL 的丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈混合溶劑標夜和基質標液，每個濃度梯度連續重復測定6次，測試其相關系數、重現性和準確度。結果顯示，在0.01 u g/mL濃度下，4種農藥的重現性不好，因此檢出限0.01 u g/mL，在0.02～0.48 u g/mL 線性范圍下，4 種農藥的溶劑標和基質標線性方程相差不大，溶劑標相關系數R2≥0.999 41，基質標相關系數R2≥0.999 38（見表3）?；|標工作曲線如圖2—圖5。

圖2 丁蟲腈工作曲線

圖3 丁香菌酯工作曲線

圖4 氯啶菌酯工作曲線

圖5 乙唑螨腈工作曲線

表3 4種農藥的線性范圍、線性方程、相關系數（n=6）

2.4 基質效應探索

使用標準GB/T 20769—2008、NY/T 761—2008、GB/T 23200—113、GB/T 23200—121 規定的檢測方法，甲胺磷、氧樂果等非極性農藥會出現基質效應，為了探索基質效應影響，本文使用樣品前處理中空白樣品所得的溶液配置基質標液，并與溶劑（乙腈）標的精確度、樣品添加回收率進行對比，以此來判斷基質效應的影響，消除誤差。

從表4、表5可以看出，2種定量方式中，不管是哪個濃度的添加，結果平行度相當可觀，且結果接近理論添加值，另外，在0.02 mg/kg的添加濃度上，4種農藥的回收率均接近100%，足以證明此檢測方法精密度相當高。

表4 13個荔枝樣品的檢測結果（溶劑標定量）

表5 13個荔枝樣品的檢測結果（基質標定量）

從回收率和標準偏差來看，如表6顯示：2種定量方式中，不管在哪個添加濃度水平下，4種農藥都保持著較好的回收率，回收率基本維持在86%～105%之間，完全符合農殘標準中回收率在70%～120%的要求。從標準偏差來看，溶劑標定量RSD在1.4%～1.9%，而基質標定量RSD在2.4%～2.9%，2種方式定量精密度都相當高。另一方面，這4種農藥在0.02 mg/kg 的添加濃度上都具有較好的回收率，說明這4種農藥的定量檢出下限值≤0.02 mg/kg。

表6 4種農藥在添加濃度為0.02～0.48 mg/kg下的平均回收率（n=6）

3 結論與討論

本文采用Quechers前處理法，結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定，建立了荔枝中丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈農藥殘留的檢測方法。從實驗結果看，線性方程、線性范圍、標準偏差、添加回收率、檢出限量、平行程度、基質效應等都達到了較高水平，符合相關標準要求，且該方法前處理簡單、方便快速，具有良好的靈敏度、準確度和精密度，因此是科學有效、可以推廣的。鑒于丁蟲腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈作為我國自主研發的農藥在國內外都已經注冊了相關專利，從目前調查研究和實驗結果來看，此4 種農藥必將在蔬菜、水果、水稻、棉花等重要農作物上得到大力推廣使用，因此，本文具有非常重要的意義，可為其他蔬菜、水果等農產品的農藥殘留檢測提供依據。