褪黑素誘導增強生防芽孢桿菌DZY 6715對油茶炭疽病的抑制作用*

劉地，楊闊，杜倩潔，周慧琴，鄧佳，，伍健榕，王芳，3

(1.西南林業大學 林學院，云南 昆明 650224；2.西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650224；3.西南林業大學 西南地區生物多樣性保育國家林業和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224)

油茶(Camelliaoleifera)為山茶科(Theaceae)山茶屬小型常綠喬木或灌木，是我國特有的木本油料植物[1]。油茶炭疽病是油茶的主要病害，重病區產量可縮減40%～80%[2]。根據研究報道，油茶炭疽病的病原菌有8種，如油茶果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)和暹羅炭疽菌(C.siamense)等，其病原菌在油茶整個生育期均可侵染[3-4]。目前，對于油茶炭疽病的主要防治措施是化學防治[5]。使用化學農藥防治油茶炭疽病，雖然能高效降低油茶損失，但由于炭疽病病原菌具有較強的適應能力，容易使病原菌產生抗藥性，還會對植物造成氧化脅迫使植物生長受抑[6]。因此，尋找安全無害的防治方法是研究的重要方向。目前，利用拮抗細菌控制病害的方法顯示出了巨大的應用前景。國內外已有報道證明，芽孢桿菌(Bacillustequilensis)具有廣譜抑菌性，抑菌機理較為復雜，通常是多種抑菌機制協同發揮作用[7-8]。芽孢桿菌防治病原菌的方式主要有：與病原菌進行營養競爭和生態位點競爭來防治病原菌；形成生物膜提高其生防效果[9]；產生多種抗菌物質[10-11]來造成細胞畸變，使原生質發生凝集和外溢[11-12]；分泌幾丁質酶、葡聚糖酶等裂解酶來抑制病原菌菌絲生長；通過破壞細胞膜完整性和誘導孢子中活性氧的積累來抑制病原菌的生長[13-15]。此外，芽孢桿菌還可以通過促進植物生長并分泌次生代謝產物或誘導系統抗性(ISR)來防治植物病害[16]。如：徐睿等[3]發現以枯草芽孢桿菌YL 13發酵液對暹羅炭疽菌抑制效果可達到68.03%；曹娜等[17]發現芽孢桿菌發酵液具有較好的穩定性，能使病原菌菌絲發生形態變化。

芽孢桿菌DZY 6715是一株內生拮抗芽孢桿菌，對油茶炭疽病害有很好的生防效果[18]，但是其防治效果與化學殺菌劑相比仍有很大差距。褪黑激素(melatonin，MT)在植物體生理調節、增強植物抗逆性方面起著非常重要的作用[19-20]，可激活冷害[21]、干旱[22]和鹽脅迫等多種非生物脅迫下植物的抗氧化系統，通過提高植物防御酶活性和其相對基因表達量等來提高植物的抗逆性[21]。劉亞萍[23]發現，當白菜(Brassicarapavar.glabra)灌施400 μmol/L的褪黑素溶液時，可有效降低根腫病的病情指數和發病率。目前，關于MT誘導的植物抗病內容較為豐富，但當MT作為一種誘導因子直接作用于拮抗細菌進而提高其生防效力的研究目前尚無報道。本研究以油茶為實驗材料，研究特基拉芽孢桿菌DZY 6715對暹羅炭疽菌的生防效果，以探究褪黑素誘導芽孢桿菌DZY 6715抗油茶炭疽病的抗病機理。該研究結果將為探尋提高DZY 6715生防效力的途徑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌

炭疽病原菌 暹羅炭疽菌(CS)。

生防菌 特基拉芽孢桿菌DZY 6715(BacillustequilensisDZY 6715)，由西南林業大學西南地區生物多樣性保育國家林業和草原局重點實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2 油茶品種

2 a生的油茶幼苗(長林系列)，購買于江西吉安，現種植于西南林業大學。

1.1.3 培養基

PDA培養基、LB培養基。

1.1.4 誘導物制備

褪黑素購于上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司。參考Jiang等[24]和何歡等[25]的方法配制不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)褪黑素溶液并避光保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同濃度褪黑素對芽孢桿菌DZY 6715生長的影響

將預先培養并調整濃度為1×107CFU/mL的芽孢桿菌DZY 6715菌懸液(按1%接種量)加入至含有不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)的LB液體培養基中培養(28 ℃、140 r/min)，分別于12、24、48、72、96、120 h收集菌懸液并測定OD600值。以培養時間為橫坐標，菌液OD600為縱坐標繪制其生長曲線。

1.2.2 不同濃度褪黑素誘導下芽孢桿菌DZY 6715對炭疽菌菌絲的抑菌活性測定

平板對峙方法參照周璦婷[19]。處理組為不同誘導時間(24、48、72、96、120 h)和誘導物MT不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)，對照組為水。在7 d時測量對照組病原菌菌落半徑(R1)和對峙組病原菌菌落中心到DZY 6715菌落邊緣的距離(R2)，并計算對病原菌菌絲的生長抑制率(R抑)。每個處理3個重復，公式如下。

1.2.3 不同濃度褪黑素誘導下芽孢桿菌DZY 6715生物膜成膜能力測定

使用結晶紫染色法，取單菌落接種到不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)的LB液體培養基中，于28 ℃、140 rpm條件下誘導培養，并于72 h取樣1 mL加入至24孔板中，后加入等體積的LB液體培養基靜止培養。分別于24、48、72、96 h進行0.1%結晶紫染色，40%冰醋酸溶解，并在紫外分光光度計下測定在560 nm處的吸光值。每個處理3個重復。

1.2.4 褪黑素誘導下芽孢桿菌DZY 6715胞外水解酶活性測定

將芽孢桿菌DZY 6715接種到不同濃度MT(0、50 μmol/L)的 LB液體培養基中，于28 ℃、140 rpm條件下誘導培養，并于24、48、72、96、120 h收集菌懸液，測定幾丁質酶(chitinase)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，β-1,3-GA)活性，每處理3個重復。操作步驟按照試劑盒說明書進行(試劑盒購買于蘇州科銘生物技術有限公司)。幾丁質酶酶活表示方法為每毫升培養液每小時分解幾丁質產生1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活單位〔mg/(h·mL)〕，β-1,3葡聚糖酶酶活表示方法為每1 mL血清(漿)每小時產生1 mg還原糖定義為一個酶活性單位〔mg/(h·mL)〕。

1.2.5 褪黑素誘導下芽孢桿菌DZY 6715對炭疽病原菌菌絲破壞作用

將芽孢桿菌DZY 6715接種到不同濃度MT(0、50 μmol/L)的LB液體培養基中，于28 ℃、140 rpm/min條件下誘導培養，并于72 h收集菌懸液，加入CS病原菌菌絲，制成混合液，以無菌培養液為對照，每處理3個重復。28 ℃、180 rpm/min培養后，分別于24、48、72、96、120 h取樣，測定電導率，10 000 rpm、4 ℃離心10 min后測定OD260，丙二醛含量(nmoL/g)和可溶性蛋白含量(mg/mL)測算按照試劑盒說明書進行(試劑盒購買于蘇州科銘生物技術有限公司)。

1.2.6 不同濃度褪黑素誘導下芽孢桿菌DZY 6715對油茶炭疽病的抑制作用

選取健康且大小一致的2 a生‘長林系列’油茶葉片作為接種對象，用75%酒精將葉片消毒30 s，再用無菌水將葉片清洗3次后晾干；浸泡到MT誘導后的菌懸液(0、50、100、200、400 μmol/L)和不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)溶液中，每個處理9個重復。放置2 h后，使用一次性注射器將葉片葉脈兩側挑破，接種直徑為6 mm 的炭疽菌塊，置于鋪有滅菌濾紙的培養皿中，每天觀察發病情況并測定病斑面積。

1.2.7 不同誘導時間下芽孢桿菌DZY 6715對油茶炭疽病抗病性的影響

葉片處理方法同1.2.6。葉片用菌懸液(50 μmol/L MT誘導72 h)浸泡處理，分別于放置2、6、12、18、24、30 h后接種直徑為6 mm 的炭疽菌塊，每天觀察發病情況并測定病斑面積。

1.3 數據分析

利用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法和t檢驗進行差異顯著性檢驗(α=0.05)。采用Origin 2018軟件進行數據處理和圖形制作，Photoshop 軟件進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 不同濃度褪黑素對芽孢桿菌DZY 6715生長的影響

芽孢桿菌DZY 6715的OD600隨著培養時間的延長逐漸升高，即其細胞濃度隨著培養時間的延長逐漸升高并于72 h進入穩定期(圖1)。進入穩定期后，50 μmol/L MT誘導下DZY 6715的細胞濃度顯著高于其他濃度褪黑素誘導下的細胞濃度，且在50 μmol/L MT誘導下DZY 6715的細胞濃度在72、96、120 h分別是未誘導的1.57、1.17和1.52倍，表明50 μmol/L MT誘導處理顯著提高了芽孢桿菌DZY 6715的細胞濃度。

圖1 不同濃度MT處理的芽孢桿菌DZY 6715 的OD600

2.2 不同誘導時間和褪黑素濃度下芽孢桿菌DZY 6715對炭疽菌菌絲的抑菌活性

MT誘導的芽孢桿菌DZY 6715對炭疽菌的抑制效果顯著高于未誘導菌株(表1)，各處理抑菌率均高于50.00%。抑菌率隨著誘導時間的延長呈先上升后下降趨勢，其中褪黑素在50 μmol/L水平時，在不同誘導時間(24、48、72、96、120 h)下的抑菌率顯著高于其他處理組，且不同濃度MT(50、100、200、400 μmol/L)在誘導72 h時抑菌率最高，分別為76.33%、72.33%、71.67%和68.67%。

表1 不同濃度MT和誘導時間下芽孢桿菌DZY 6715對炭疽菌菌絲的抑制率Tab.1 Inhibition rate of Bacillus tequilensis DZY 6715 on anthracnose mycelium under different concentrations of MT and different induction time

由圖2可以看出，不同濃度MT誘導DZY 6715處理對炭疽菌菌絲并無明顯影響，但在MT誘導72 h之后，可以明顯看出芽孢桿菌DZY 6715在營養體上擴散面積最廣，這可能是其抑制率增強的原因。

圖2 不同濃度褪黑素誘導DZY 6715處理對炭疽菌菌絲生長的影響Fig.2 Effects of B.tequilensis DZY 6715 treatment induced by different melatonin concentrations on hyphal growth of anthrax

2.3 不同誘導時間誘導下芽孢桿菌DZY6715生物膜成膜能力

由圖3可以看出，MT處理下的生物膜與未處理的均存在差異，所有處理培養時間與生物膜成負相關關系，培養時間越久生物膜形成能力越弱。未誘導菌株在24～48 h生物膜產量逐漸上升，72～96 h產量下降，且在靜置培養96 h時，生物膜出現解離、浮游的狀態。經MT誘導后的DZY 6715，其生物膜的產量明顯提高且與未誘導菌株的變化趨勢大致相同，但在96 h時未觀察到解離狀態；MT處理后在靜置培養12～24 h、24～96 h分別處于最初的黏附、成膜的穩定的階段。50 μmol/L MT處理的DZY 6715各時間段內生物膜產量均有上升，顯著優于對照組，表明經50 μmol/L MT處理后的DZY 6715具有較強的生物膜形成能力，其菌懸液在靜置培養24 h時OD560達到最大值，生物膜厚度明顯變厚，褶皺變多，顯著高于其他MT濃度處理組，這可能有助于其在植物表面定殖。

圖3 不同MT處理對DZY 6715生物膜OD值的影響

2.4 50 μmol/L褪黑素誘導下芽孢桿菌DZY 6715胞外水解酶活性

由圖4可知，經MT誘導過后的菌液內幾丁質酶活性在不同時間段內均顯著升高。不同誘導時間下50 μmol/L濃度菌液幾丁質酶活性分別為2.13、2.23、2.19、2.27、2.30 U/mL。表明MT誘導處理可使菌體內幾丁質酶活性升高，從而達到抑菌目的。菌液的β-1,3-葡聚糖酶活性呈現先升高后下降趨勢，且MT處理組的該酶活性均較對照組顯著升高。在72 h、 50 μmol/L濃度處理組的β-1,3-葡聚糖酶活性達到峰值4.5 U/mL，較對照組的酶活性3.46 U/mL顯著升高了31%。表明經MT誘導處理后的發酵液β-1,3-葡聚糖酶活性顯著升高，能使細胞壁降解，抑制菌絲生長。

圖4 褪黑素誘導下芽孢桿菌菌液胞外水解酶活性

2.5 芽孢桿菌DZY 6715對炭疽病原菌菌絲的破壞作用

如圖5所示，對照組MDA濃度在120 h時間段內呈現先上升后下降趨勢，處理間無顯著變化；與對照組相比，相同時間50 μmol/L MT處理組菌絲體MDA濃度顯著上升(P<0.05)，均高于對照組和未誘導菌株，且MT處理組MDA濃度維持在較高水平，基本呈現拮抗越久，菌絲體MDA含量越高。

圖5 MT誘導芽孢桿菌對炭疽菌的破壞作用

對照組菌體培養液中蛋白質含量極低；經MT誘導下的DZY 6715發酵液作用后，蛋白質含量迅速增加，后趨于穩定。在培養48 h時間段，50 μmol/L MT處理發酵液是對照組的13.5倍，對比未誘導菌株上升61.6%。推測MT誘導后的發酵液可能破壞了炭疽菌菌體細胞膜的完整性，導致培養液中蛋白質含量增加。

當微生物細胞膜遭到較大破壞時，核酸等大分子物質也會釋放到細胞外。核酸在波長260 nm處有很強的紫外吸收，測定細胞外OD260有助于判斷菌體細胞膜破壞程度。如圖5所示，OD值是隨著時間而升高，MT誘導處理與未誘導菌株菌液趨勢一致，但50 μmol/L MT處理發酵液OD值對比未誘導菌株菌液存在顯著差異，在120 h時間段中達到峰值28.43 ug/uL，說明MT誘導處理的DZY 6715增強炭疽菌核酸泄露。

在整個時段內，MT處理和CK的菌絲相對電導率總體上都呈現一個上升的趨勢，且MT處理較對照組顯著增加，在培養72 h時達到最大值88.09%，是對照組的1.12倍。說明與CK相比，MT處理下的炭疽菌絲的損傷程度增大，通透性增加，加速菌體細胞質滲漏到細胞外。

2.6 不同濃度MT誘導下芽孢桿菌DZY 6715在離體葉片上對炭疽菌的抑制作用

如圖6、7所示，在不同濃度MT誘導下，72 h的芽孢桿菌DZY 6715在離體葉片上對炭疽病病原菌都有一定的抑制作用，且MT誘導DZY 6715處理病斑面積均小于對照組和純培養，呈現病斑面積隨MT濃度增加而增大的趨勢。其中50 μmol/L MT處理發酵液有較好的抗病效果，病斑面積顯著縮小，是對照組的15.3%，純培養的28.4%。而不同濃度MT溶液對病斑面積并無明顯影響，基本呈現病斑面積隨MT濃度增加而減小的趨勢，說明單獨使用MT對油茶的病斑大小無顯著影響。

圖6 不同MT處理芽孢桿菌DZY6715對油茶葉片炭疽病的控制效果

圖7 不同MT處理芽孢桿菌DZY 6715和單獨MT對炭疽病的控制效果

2.7 發酵液處理葉片時間對炭疽病的控制效果

由圖8可以看出，對比對照組來說，MT處理均對葉片病斑面積的擴增有明顯的抑制效果，其中，第2 h和24 h處理組效果比較明顯，較對照組縮小84.1%和88.46%。

圖8 發酵液處理葉片時間對炭疽病的控制效果Fig.8 Control effect of leaf time on anthracnose

3 討論與結論

已有研究證明，天然高分子化合物可有效提高生物防治效果，化合物作為激發子誘導培養可顯著提高生防菌的拮抗效力[26]，促進生防菌生長繁殖和菌株活力等。本研究結果表明低濃度MT(50 μmol/L)誘導DZY 6715菌懸液細胞數量增加，且顯著高于未誘導菌株，細胞濃度在72 h時達到峰值，說明MT作為生物激發子在低濃度條件下對菌株DZY 6715有一定促進生長作用，使細胞活力增強，種群密度上升。隨著MT濃度的逐漸升高，其對芽孢桿菌DZY 6715的促進生長作用逐漸降低，且隨著濃度的進一步升高會呈現抑制作用，與此結果類似，有研究報道當濃度高于1 000 μmol/L會顯著抑制芽孢桿菌的等的生長[27]。推測MT對芽孢桿菌生長的影響可能遵循報酬遞減規律，這與Yu等的結果相似[28]。而當拮抗菌株達到一定的種群密度，就可能會產生群體效應由單細胞形態轉變為生物膜形態[29]，幫助菌體更好地附著于植物表面，在激活植物防御反應、拮抗病原微生物等方面幫助植物抵御病害侵染。生物膜的形成可能是拮抗菌防治病害的新機理之一。MT誘導可以增強DZY 6715的生物膜形成能力，進而提升其對油茶炭疽菌的抑制作用。本研究結果表明，50 μmol/L MT誘導72 h的DZY 6715在平皿對峙試驗中對炭疽菌的抑制率可達到76.33%，顯著高于未誘導菌株。同時50 μmol/L MT誘導72 h 的DZY 6715在葉片上也能控制炭疽病病斑的擴展，這可能是50 μmol/L MT誘導72 h的DZY 6715細胞活力最強，能迅速占領空間，從而有效地與病原菌形成營養與空間上的競爭，抑制炭疽病菌的入侵和繁殖。此外，誘導菌株對油茶葉片的處理時間也顯著影響其對炭疽病原菌的控制，處理24 h時病斑面積最小，這可能是由于50 μmol/L MT誘導72 h 的DZY 6715菌株生物膜形成能力在24 h時最強，且在葉片上處理24 h后，對病原菌產生了系統抗病性。這與何方濤[30]的研究結果類似，誘導激發培養后提高了拮抗菌對病原菌的控制效力，生防菌在抑菌過程中分泌一些物質如幾丁質酶、葡聚糖酶，可破壞真菌細胞的細胞壁。林福呈等[31]研究發現，細菌可以進入真菌細胞壁繁殖并分泌溶菌物質。本研究中MT誘導可以增強DZY 6715幾丁質酶、葡聚糖酶活性，破壞真菌細胞壁。細胞膜是真菌組織結構的一部分，能夠維持正常的生理結構，有效調節內外環境的穩態，保障其正常生命活動[32]。已有研究表明，許多芽孢桿菌可以分泌次級代謝產物如surfactin、fengycin和difficidin等抗菌物質，這些物質可以破壞真菌細胞壁，通過改變真菌細胞膜的通透性來破壞其內外環境的穩態，從而起到抑菌作用。病原菌細胞膜受損，其內含物外滲，培養液電導率增加。MDA是膜脂過氧化的主要產物，能夠衡量菌絲體的膜脂過氧化水平[32]。Yang等[33]研究發現戊二醛處理使病原菌細胞內積累大量活性氧，且MDA含量劇增，表明菌絲體發生了脂質過氧化反應，膜系統受損。而細胞膜被破壞，通透性增加，隨后釋放細胞內的大分子蛋白和核酸，菌體蛋白質和核酸外泄會嚴重影響正常的生命活動[34]。Wang[35]等研究也發現，在灰霉菌細胞膜被破壞后，會導致細胞內的大分子蛋白和核酸釋放。本研究中，經50 μmol/L MT誘導DZY 6715處理的病原菌菌絲，其電導率和MDA顯著高于未誘導菌株，OD260和可溶性蛋白的含量增加，說明MT誘導DZY 6715增強其對炭疽菌細胞結構的破壞，使病細胞膜的通透性增加，釋放細胞內的核酸和蛋白。綜上，MT誘導芽孢桿菌DZY 6715可以通過分泌相關活性酶如幾丁質、葡聚糖酶，破壞病原菌的細胞壁和細胞膜，使菌體內含物外泄，進而達到溶菌目的。

實驗發現，MT處理和未誘導菌株的DZY 6715菌懸液對油茶葉片的抗炭疽病效果也有不同，其中50 μmol/L MT平板對峙抑菌率為76.33%，表明誘導后的菌株與病原菌對峙培養后，能迅速占領空間，從而有效地與病原菌形成營養與空間上的競爭[35-36]。葉片離體實驗表明，MT誘導后的芽孢桿菌DZY 6715處理油茶葉片，其病斑面積縮減，50 μmol/L MT處理表現最佳，這與何方濤[30]的研究結果類似，誘導培養后提高了拮抗菌對病原菌的控制效力。由50 μmol/L MT誘導的DZY 6715處理后，再放置不同時間后接種病原菌于葉片，均可誘導葉片產生抗病性，從而增強植株自身防御反應，且以放置24 h后病斑面積最小。這可能是因為DZY 6715菌株的生物膜形成能力在24 h時最強，可以在油茶葉片上進行定殖，從而提高拮抗能力，而單獨施用MT對油茶葉片抗病并無明顯作用。

綜上所述，本研究結果表明低濃度的MT誘導可以促進芽孢桿菌DZY 6715生長，且50 μmol/L MT誘導后的菌株生防效果最好；MT作為誘導激發子低濃度時可以增強芽孢桿菌DZY 6715對暹羅炭疽菌的抑制效果，且50 μmol/L MT誘導72 h的DZY 6715菌株效果最好；誘導的DZY 6715菌株具有較強的生物膜形成能力，分泌幾丁質和葡聚糖酶，破壞了病原菌菌絲的結構，改變細胞膜的通透性，使細胞內物質泄漏，從而使病原菌溶解死亡。本研究結果可為油茶高效生防菌劑開發利用提供理論參考，使其大規模應用并替代傳統化學殺菌劑成為可能。然而，雖然明確了MT作為誘導激發子可以增強芽孢桿菌DZY 6715對油茶炭疽病病菌的抑制作用，但其抑菌機制和抗病機理尚不明確。后續宜對植物微觀結構、生理生化及轉錄水平進一步深入研究。