高效液相色譜法同時測定密胺制品中14 種熒光增白劑殘留量及遷移量

賀敏 李銳 周瑩 林依哲

（國家食品軟包裝產品及設備質量監督檢驗中心（廣東））

熒光增白劑（fluorescent whitening agengts,FWAs）是具有對稱共軛的有機芳環和共軛雙鍵的熒光染料，受300~400 nm 紫外光激發后，可輻射出420~480 nm 的藍、紫光，在視覺上達到增白的效果，提高產品亮度[1]。我國塑料用熒光增白劑主要有4 類[1-3]：苯并惡唑類（如FWA184、FWA 393 等）；二苯乙烯基苯類（如FWA199 等）；香豆素類（如FWA140、FWA162 等）；二苯乙烯基聯苯類（如FWA378、FWA351 等）。熒光增白劑雖可以顯著提升產品的外觀性能，但有文獻表明，熒光增白劑本身含有芳香胺基和苯乙烯結構，在毒理上具有潛在的致癌風險，并且FWAs 中的活潑結構較易遷移到皮膚和血液中，在人體內與蛋白質結合后難以代謝，危害血液與肝臟健康。對此，國內外都將熒光增白劑作為食品接觸材料及制品中的添加劑進行監管，并發布了相關法規和標準來規定熒光增白劑的限用量和特定遷移量。我國GB 9685-2016 和歐盟（EU）NO.10-2011規定塑料食品接觸材料（PP、PE、PET、PS、ABS、PC 等）中FWA 184 的最大使用量為0.015~0.6%，特定遷移量（SML）均為0.6 mg/kg；FWA393 的最大使用量為 0.025%，特定遷移量均為 0.05 mg/kg；FWA236 的最大使用量為0.02~0.035%，特定遷移量則不得檢出，但塑料密胺制品中熒光增白劑的最大使用量和遷移量并未規定。因此，一些產商向密胺制品中添加可遷移性熒光增白劑以增加產品的白度和鮮艷度，這類產品在使用中熒光增白劑可能遷移到食物中，危害人體健康。所以，發展快速高效的方法來檢測密胺制品中熒光增白劑的殘留量和遷移量對密胺制品的質量安全生產具有重要意義。

目前，熒光增白劑的檢測方法集中在紙制品、化妝品、洗滌劑、紡織品和塑料制品（PS 制品、食品包裝袋、兒童玩具）等方面，而塑料密胺制品中熒光增白劑的研究極為少見。熒光增白劑的分析方法一般有分子熒光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法[2-4]。分子熒光光度法和紫外分光光度法只能定量，而無法定性。液相色譜-串聯質譜法定性定量準確，但儀器昂貴，檢測成本高，難以普及。所以，本文采用高效液相色譜法同時檢測密胺制品中14種熒光增白劑的殘留量和遷移量，以期為密胺產品質量安全監管和相關標準制定提供技術支持。

1. 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（FLD）：1260 型，安捷倫科技（中國）有限公司；超聲波清洗器：AS2205115型，天津奧特賽恩斯科技有限公司；電子天平：CPA225D 型，感量0.05 mg，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；全自動樣品快速研磨儀：JX-FASTPRP 型，上海凈信科技有限公司。

標準物質：熒光增白劑 220（FWA220，CAS:16470-24-9）、熒光增白劑210（FWA210，CAS:28950-61-0）、熒光增白劑351（FWA351，CAS:27344-41-8）、熒光增白劑162（FWA162，CAS:3271-05-4）、熒光增白劑 135（FWA135，CAS:1041-00-5）、熒光增白劑 199（FWA199，CAS:13001-40-6）、熒光增白劑367（FWA367，CAS:5089-22-5）、熒光增白劑 393（FWA393，CAS:1533-45-5）、熒光增白劑 368（FWA368，CAS:5242-49-9）、熒光增白劑 184（FWA184，CAS:7128-64-5）；熒光增白劑 85（FWA85，CAS:12224-06-5）、熒光增白劑 33（FWA33，CAS:61902-19-0）；熒光增白劑140（FWA140，CAS:91-44-1）、熒光增白劑 378（FWA378，CAS:40470-68-6）；甲醇、乙腈均為HPLC 級，四丁基溴化銨（TBAB，99%）、三乙胺（AR）。

1.2 標準溶液配制

于100 mL 棕色容量瓶中分別稱取14 種熒光增白劑標準品各10 mg 溶解，定容至刻度，所得標準儲備液濃度100 mg/L。其中FWA220，FWA 210 用水溶解、FWA85、FWA140 用甲醇溶解，FWA351、FWA378 用乙腈/水溶解，FWA33、FWA 162、FWA135 用甲醇/乙腈溶解，FWA199、FWA 367、FWA393、FWA368、FWA184 用甲醇/二氯甲烷溶解。

1.3 樣品前處理

將密胺制品處理成較小塊狀物后，經液氮冷凍10 min，通過樣品研磨儀快速研磨成粉末狀。準確稱取0.5 g 粉末狀樣品于25 mL 比色管中，加入20 mL 提取液(MeCN:H2O:Et3N = 40:60:1)，超聲提取后靜置過濾，提取液定容至25 mL。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK PFP(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動相：A 相為20 mmoL TBAB 甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺調節溶液pH=9），B 相為乙腈，C 相為甲醇；流速：0.8 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；熒光檢測器激發波長為350 nm，發射波長為430 nm。梯度洗脫程序如表1 所示。

表1 梯度洗脫程序

2. 結果與討論

2.1 液相色譜條件優化

2.1.1 色譜柱的選擇

本文主要考察了3 種常用色譜柱（OSAKA SODA CAPCELL PAK PFP (4.6 mm×250 mm×5μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm× 250 mm × 5 μm) 和 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)）對14 種熒光增白劑的分離情況。結果表明，C18 柱和SB-C18柱對FWA220 和FWA210、FWA367 和FWA393等結構和極性類似的熒光增白劑難以實現色譜分離，而PFP 五氟苯基柱對具有相似苯環結構的化合物可實現較好的分離，并通過進一步調節流動相比例、流速和柱溫，增加分析時間來改善 14種熒光增白劑的峰型和分離情況。

2.1.2 流動相的選擇

本文研究的14 種熒光增白劑含有一部分帶強極性磺酸基的水溶性化合物，這類物質在C18柱上保留較差。因此為了增強其保留，在堿性條件下加入正離子對試劑四丁基溴化銨（TBAB）與磺酸基結合來減小極性，并參考相關文獻所提出的色譜條件[6-7]，選擇10 mmoL TBAB 甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺調節溶液pH=9）為A 相，通過調節B 相乙腈，C 相甲醇的比例進行流動相優化，部分熒光增白劑色譜峰拖尾較為嚴重。當流動相A 中四丁基溴化銨濃度增加至20 mmoL，14 種熒光增白劑的峰形得到改善，且實現成功分離，如圖1 所示。而使用20 mmoL 乙酸銨-甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺調節溶液pH=9），色譜峰拖尾嚴重且無法實現分離，無法滿足檢測要求。此外，研究了流動相流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）對14 種熒光增白劑分離情況的影響，流速較大，FWA220 和FWA210、FWA184和FWA378 色譜峰部分重疊，難以分離。

圖1 20 mmoL TBAB 甲醇水溶液

2.2 熒光增白劑殘留量提取條件優化

2.2.1 提取溶劑的優化

本文考察了70%DMF 溶液、乙腈-水-三乙胺（40:60:1）、4%乙酸溶液、三氯甲烷、甲醇-水（1:1）、乙腈-水（1:1）、甲醇-水-三乙胺（40:60:1）7 種提取溶劑對密胺制品中熒光增白劑的提取效果，如圖2 所示。結果表明，乙腈-水-三乙胺（40:60:1）對密胺制品中熒光增白劑的提取效果最好。同時，鑒于本文所研究的熒光增白劑大多為陰離子型熒光增白劑，堿性環境更有利提取和檢測，因此，我們對4%乙酸提取液用三乙胺堿化后進行檢測，對檢測結果影響不大。

圖2 不同提取溶劑對熒光增白劑的提取效果

2.2.2 提取溫度的優化

超聲溫度和超聲時間是影響提取效率的重要因素。本文考察了超聲提取溫度（30、50、70、80℃）對密胺制品中熒光增白劑提取量的影響。結果表明，超聲提取溫度為50℃時，提取量達到最大值，隨后溫度增加，提取量下降，可能是因為溫度升高，提取液中有機溶劑揮發，提取效率下降，如圖3 所示。因此，選擇50℃為提取溫度。

圖3 提取溫度對熒光增白劑的提取效果

2.2.3 提取時間的優化

其次，本文考察了超聲提取時間（30、60、90、120 min）對密胺制品中熒光增白劑提取量的影響。結果表明，超聲提取時間越長，提取效率越高，但是超聲提取60 min 后，提取效率增長緩慢，提取量趨于穩定，如圖4 所示。因此，選擇60 min 為提取時間。

圖4 提取時間對熒光增白劑的提取效果

2.3 線性范圍和檢出限

本文在上述最優色譜條件下，對14 種熒光增白劑的系列標準工作溶液進行測定，以質量濃度X(mg/L)為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標繪制標準工作曲線，計算線性方程及相關系數，并采用空白加標的方法，以3 倍信噪比確定方法檢出限，10 倍信噪比確定定量限，如表2 所示。

表2 14 種熒光增白劑的線性范圍、檢出限和定量限

由表2 可知，14 種熒光增白劑在一定質量濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數均不低于0.998，滿足分析要求。當稱樣量為0.5 g、定容體積為25 mL 時，14 種熒光增白劑的檢出限為0.01~0.3 mg/kg，定量限為0.03~1.0 mg/kg。

2.4 回收率和相對標準偏差

本文采用在空白樣品中添加標準溶液的方法進行加標回收重復性實驗，設置低、中、高3 個加標水平，每個加標樣品平行測定8 次，回收率和相對標準偏差結果見表3。結果表明，14 種熒光增白劑加標回收率為88.55%~114.23%，相對標準偏差（RSD）為0.28% ~ 8.90%，方法的重復性和精密度均能滿足定量分析的要求。

表3 14 種熒光增白劑的回收率和相對標準偏差（n=8）

2.5 實際樣品中熒光增白劑殘留量和遷移量的測定

應用所建立的分析方法，對市售50 批次密胺制品（碗、碟、盤）進行殘留量和遷移量的檢測。殘留量檢測結果表明密胺制品中檢出FWA 33，含量為0.35~7.05 mg/kg；FWA 184 含量為0.015~0.034 mg/kg；FWA 378 含量為0.017~0.067 mg/kg；其他熒光增白劑均未檢出。隨后，按照GB 31604.1-2015 和GB 5009.156-2016 的要求，本文在70℃，2 h 和100℃，2 h 兩種遷移條件下，采用4%乙酸、50%乙醇和橄欖油3 種食品模擬物對密胺制品進行三次遷移試驗，檢測結果表明，第三次遷移試液中均未檢出熒光增白劑。

3. 結論

本文建立了高效液相色譜-熒光法同時檢測密胺制品中14 種熒光增白劑殘留量和遷移量的分析方法，此法前處理簡便、靈敏度高、重復性優異，其線性關系、精密度和準確度均能滿足定量分析的要求。該法可成功用于實際樣品中熒光增白劑殘留量和遷移量的檢測，可為密胺制品質量安全監管提供科學依據。