失代償期肝硬化并發自發性細菌性腹膜炎患者危險因素和PBMC CD36/mTORC1信號通路變化研究*

張迎迎,魏珂樂,丁 鶴,郭慧杰,崔 軼,王 昳

肝硬化為內科常見疾病,病程較長,為多種病因長期反復破壞肝組織功能而誘發的彌漫性肝損傷[1]。肝硬化存在結節性再生和漸進性肝細胞壞死,而炎癥刺激纖維結締組織增生,導致肝小葉結構變化,肝臟變硬,肝功能損傷。在肝硬化早期,肝功能代償能力較強,臨床癥狀隱匿,而在肝硬化后期則會出現肝功能受損和門靜脈高壓,累及全身系統,出現腹水、感染或癌變等表現[2]。自發性細菌性腹膜炎(SBP)為失代償期肝硬化嚴重的并發癥之一,主要是由致病菌經淋巴系統、腸道、血液進入引起的腹腔感染。SBP與肝病患者終末期高病死率相關[3]。當前,致病菌對抗菌藥物的耐藥性增加,給臨床治療帶來了嚴峻的挑戰。因此,了解失代償期肝硬化患者病原菌分布及其耐藥特點,探尋引起感染的危險因素,是臨床防治研究的重點。應用抗生素治療可控制或治愈感染,但仍需研究感染的發生機制,以便做好預防[4,5]。炎癥為機體對外界刺激產生的自身防御反應,一般分為非感染性炎癥和感染性炎癥。在感染發生時,往往會激起機體自身免疫反應功能,并調節體液分子和免疫細胞抵御病原菌的侵襲。從機體炎癥反應著手,有望成為臨床抗感染治療的新方向[6-8]。分化抗原36(cluster of differentiation 36,CD36)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1(mammalian target of rapamycin 1,mTORC1)通路是機體調節炎癥反應的重要通路,其中CD36為B型清道夫受體,可在跨膜結構的細胞質外環狀部分介導下結合特異性受體,誘發炎癥反應;mTORC1為細胞活動中心協調器,可感知激素、氨基酸、生長因子、營養等變化,對細胞存活、分化、生長和增殖進行調節,其表達水平異常與炎性疾病的發生相關[9-11]。本研究檢測了失代償期肝硬化并發SBP患者CD36/mTORC1信號通路表達,并探討了它們的臨床意義,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2020年7月～2023年12月我院診治的失代償期肝硬化患者82例,男55例,女27例;年齡為39～76歲,平均年齡為(54.2±6.3)歲。符合失代償期肝硬化的診斷標準[12]和SBP的診斷標準[11],后者即腹水白細胞計數在250×106/L以上,發熱、腹部壓痛、反跳痛、對利尿劑治療應答差,腹水細菌培養陽性。其中乙型肝炎肝硬化49例,丙型肝炎肝硬化5例,酒精性肝硬化20例,原發性膽汁性肝硬化8例。排除標準：(1)癌性、結核性腹水;(2)近期有腹部手術史或繼發性感染;(3)合并全身性感染。

1.2 病原菌檢測 在無菌條件下,抽取腹水10 ml,進行厭氧和需氧菌培養,并采用美國臨床實驗室提供的MicroSean Auto-4全自動細菌鑒定儀進行細菌鑒定。

1.3 臨床資料收集 收集患者性別、年齡、并發癥、飲酒史、既往SBP發生史、實驗室指標[總膽紅素(TBIL)、白蛋白(albumin,ALB)、谷草轉氨酶(aspartate、aminotransferase,AST)、谷丙轉氨酶((alanine aminotransferase,ALT)、國際標準化比值(international normalized ratio,INR)],計算終末期肝病模型(model of end-stage liver disease,MELD)評分。

1.4 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)CD36/mTORC1信號通路水平檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,PCR)法檢測PBMC CD36/mTORC1信號通路水平。清晨采集空腹肘靜脈血4 mL,加入EDTA抗凝管。采用淋巴細胞分離液分離PBMCs,采用Trizol法提取PBMCs總RNA,使用反轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)將總RNA反轉錄為cDNA,于-20℃保存備用;采用熒光定量PCR試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司)和瑞士羅氏公司生產的Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀檢測CD36 mRNA和mTORC1 mRNA水平,引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成,PCR反應體系為20 μL,包括cDNA 1 μL,上下游引物各0.4 μL,2×KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μL,加ddH2O補齊。反應條件為：95℃預變性3 min,95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸30 s(40 cycles),72℃延伸10 min。擴增產物經凝膠電泳,采用2-△△Ct計算結果,每個樣本檢測3次,取平均值。

2 結果

2.1 病原菌分離情況 本組發生SBP者43例(52.4%),分離出病原菌8株(9.8%),其中科氏葡萄球菌和溶血葡萄球菌各1株,大腸埃希菌2株,肺炎克雷伯菌2株和陰溝桿菌2株。

2.2 失代償期肝硬化并發SBP的單因素分析 SBP組與肝硬化組在既往SBP發生史、血清總膽紅素、ALB、INR、MELD評分、PBMCs CD36和mTORC1水平方面比較,差異有統計學意義(P<0.05,表1)。

表1 失代償期肝硬化并發SBP的單因素分析

2.3 多因素分析 將上述單因素分析具有統計學意義的指標賦值(未列出),并代入Logistic回歸方程,進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,SBP發生史、血清總膽紅素、ALB、MELD評分及PBMC CD36和mTORC1水平為影響失代償期肝硬化并發SBP的獨立危險因素(P<0.05,表2)。

表2 影響失代償期肝硬化并發SBP的多因素分析

3 討論

SBP為失代償期肝硬化最嚴重的并發癥之一,且發病機制復雜。當前,研究多認為與患者吞噬細胞功能降低、肝內單核-巨噬細胞系統受損和白細胞黏附趨化作用降低有關[13]。隨著醫療技術的發展,SBP治療得到一定的改善,但仍具有一定的復發率,且治療難度較大,治愈率較低,嚴重者還可能并發感染性休克,威脅患者生命健康。SBP起病隱匿,極易誘導其他器官功能衰竭[14,15]。如何降低失代償期肝硬化并發SBP的發生風險,已成為臨床亟待解決的問題之一。

SBP相關的感染病原菌特征發生了明顯的變化。針對失代償期肝硬化并發SBP患者病原學特點進行有效監控是保證臨床合理應用抗菌藥物的重要手段。本研究在43例患者分離出8株感染病原菌,提示失代償期肝硬化并發SBP患者以革蘭氏陰性菌感染為主[16]?？咕幬锏膹V泛使用不僅會增加細菌的耐藥性,還會在一定程度上改變感染的病原菌譜,需要認真監測。

本研究經Logistic回歸分析發現,過去感染SBP、血清總膽紅素、ALB和MELD評分為影響失代償期肝硬化并發SBP的獨立危險因素。高膽紅素血癥是肝功能損傷的最直接的指標,后者功能降低會改變肝臟血管通透性,增加SBP發生。SBP的發生也可在一定程度上損傷肝細胞,導致膽紅素居高不下,發展為惡性循環[17]。因此,在臨床治療方面可針對性降低膽紅素水平,阻止病情惡化。ALB和MELD評分為反映肝功能的有效指標。MELD評分越高,肝臟儲備功能越差,造成消化道淤血和門體分流,更易出現腹腔感染,增加SBP發生的機會[18]。臨床醫生應重點監護MELD評分差的患者,早期給予針對性的治療,以減少SBP的發生。

炎癥反應的本質為機體在出現組織損傷及病原微生物入侵后作出的應答反應,其中細胞因子可通過多種信號轉導途徑調節機體炎癥反應。常見的病理過程是在機體感染病毒或細菌后會出現炎癥反應,而控制機體炎癥反應具有一定的積極作用[19]。本研究發現SBP組CD36 mRNA和mTORC1 mRNA水平顯著高于肝硬化組,提示失代償期肝硬化患者在感染SBP后,機體CD36/TORC1通路蛋白表達上調。CD36為B型清道夫受體,可識別在跨膜結構胞質外環狀結構并結合特異性配體,誘導機體炎癥反應,抑制機體感染,故在機體感染后其水平顯著升高。mTORC1為細胞活動中心協調器,可感知氨基酸、生長因子、激素和營養的變化,調節細胞存活、分化、增殖和生長。mTORC1功能異常多與炎性疾病的發生發展相關[20]。CD36/mTORC1參與炎癥反應的調控,而炎癥多發生在感染之后,因此推測CD36/mTORC1參與機體感染發生和發展。此外,CD36/mTORC1信號通路與機體肝功能水平密切相關,而肝功能異常者出現SBP風險更高。我們推測CD36/mTORC1信號通路可能參與了失代償期肝硬化并發SBP的發生和發展,但仍需進行研究驗證。

綜上所述,血清總膽紅素、ALB、MELD評分、PBMC CD36 mRNA和mTORC1 mRNA水平是失代償期肝硬化患者發生SBP的獨立危險因素,PBMC CD36/mTORC1信號通路水平上調,其意義需要進一步研究。