ICU住院患者萬古霉素耐藥屎腸球菌患病率和分子流行病學調查研究

鄧雅文 張智賢 陳百計 段朝暉 謝曉英

萬古霉素耐藥屎腸球菌（VREfm）是醫院獲得性感染和疾病控制和預防中心重點監控的病原菌，約占衛生保健相關腸球菌感染的三分之一［1］。VREfm 在中國的患病率相對較低。近兩年全國耐萬古霉素屎腸球菌（VREfm）發病率從2.2%升至3.2%（http：//www.chinets.com/），我院數據亦從13.3%升至26.4%（http：//www.carss.cn/），由此可見我院的VREfm 發病率近兩年快速上升且顯著高于全國平均水平，這對醫院耐藥菌感染控制帶來了很大挑戰。通常多重耐藥菌在ICU 被檢出的比例比其他科室高，然而目前還缺乏我院VREfm 的流行病學數據。在本研究中，我們選擇ICU 進行了一項單中心研究，以評估我院ICU 中VREfm 的流行傳播情況。

1 臨床資料

1.1 一般資料2022 年6 月至2023 年7 月從ICU患者細菌培養標本中分離的21 株VREfm 納入研究，同一個患者選第一次符合條件的菌株。標準菌株屎腸球菌ATCC29212 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。本研究經中山大學孫逸仙紀念醫院倫理委員會批準（SYSKY-2023-469-01）。根據國家立法和制度要求，本研究不需要受試者法定監護人/近親屬的書面知情同意。從醫院電子病歷系統收集的患者年齡、性別、Charlson評分、合并癥、住院時間、標本類型。ICU 科室含普通ICU、急診ICU（EICU）、心血管內科ICU（CCU）、心血外科ICU、神經科ICU、兒科ICU（PICU）。

1.2 方法（1）VREfm 鑒定和藥敏實驗全部菌株復蘇后經Vitek MS 質譜儀進行重新鑒定，藥敏試驗采用Vitek2 全自動微生物分析儀的GP67 卡以及手工KB 法（替考拉寧）進行檢測，藥敏結果參照美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）2023 年標準進行判斷，替加環素采用歐洲抗微生物藥敏試驗委員會（EUCAST）標準。（2）分子流行病學選取耐藥基因vanA、vanB、vanD、vanM 進行PCR 擴增和凝膠電泳，對陽性基因送測序并在PUBMED 進行確認。屎腸球菌7 個管家基因（atpA、ddI、gdh、purK、gyd、pstS、adk）的引物序列和反應條件參考MLST網站（https：//pubmlst.org/）。所有PCR 產物進行雙向測序，并通過MLST 數據庫（http：//efaecium.mlst.net）進行序列型（sequence type，ST）比對分析。用Mega11 分析軟件構建最小生成樹分析各菌株之間的親緣關系。

1.3 統計方法對于單個患者的人口學和臨床特征，分類變量用數字和百分比進行匯總，連續變量用（±s）進行描述。所有數據均使用SPSS 23.0軟件進行分析。采用Mega11 軟件對不同背景下的相關STs 采用BURST 算法進行最小生成樹（MLST）分析。

2 結 果

2.1 VREfm 在ICU 的流行情況我院ICU 患者VREfm 患病率在2022 年下半年和2023 年上半年分別為12.12%和33.33%。VREfm 陽性患者年齡（65± 15）歲，最常見的標本類型為尿液和血液（n=5；23.81%），普通ICU 的患者攜帶VREfm 的比例最高（n=10；47.62%），腦血管疾病和糖尿病是常見的并存?。╪=7；33.33%），見表1。PCR 結果顯示，21株實驗菌株均檢出vanA 基因。見表2。

表1 2022 年-2023 年ICU 感染VREfm 患者的人口學特征及臨床特征

表2 21 株VREfm 分子流行病學及抗生素耐藥譜

2.2 抗菌藥物敏感性21 株菌均經Vitek MS 質譜儀重新鑒定確認且均表現出多重耐藥。菌株耐藥率分別為：萬古霉素（100%）、利奈唑胺（0%）、替加 環 素（9.52%）、青 霉 素（100%）、四 環 素（90.48%）、氨芐西林（100%）、紅霉素（76.19%）、左氧氟沙星（100%）、環丙沙星（95.24%）、呋喃妥因（85.71%）、替考拉寧（100%）。見表2。

2.3 分離株的遺傳分布利用7 位點MLST 將所有VREfm 菌株分為3 個STs，且均為CC17 克隆群。21株菌株中優勢STs為ST80（n=16，76.19%），其次是ST78（n=3，14.29%）和ST2460（n=2，9.52%）。2022 年下半年分離的VREfm 的STs 均為ST80，在2023 年出現了其他STs 菌株的流行。見表2。進化樹結果提示三種STs 有相同的起源，但親緣關系較遠，相同STs菌株內部親緣關系較近。見圖1。

圖1 21 株VREfm MLST 方法聚類圖

3 討 論

近幾十年來，VREfm 在ICU 的定植或感染率從13.01%到34.25%不等［2］，北京某大型教學三甲醫院ICU 患者定植比例也達31.1%［3］。本研究中，我院VREfm 檢出率高于全國平均水平，且患者呈現年齡大、病情重、合并疾病多等特點，為VRE 的傳播提供了有利條件。腸球菌的糖肽耐藥是由van 基因簇介導的，其中vanA 和vanB 基因在世界范圍內報道最多。vanM 基因在2006 年在我國首次被發現，目前流行于北京、上海和杭州等城市，但在本研究中未發現該基因的存在，這表明廣州地區的VREfm 與其他大型發達城市有差異。

攜帶vanA 抗性基因的菌株對萬古霉素和替考拉寧都具有高水平的耐藥性，稱為vanA 表型［4，5］，本研究中VRE 基因型與耐藥表型一致。三種不同基因型耐藥性有區別，ST2460 菌株對TGC 和高水平鏈霉素耐藥，屬于高耐藥菌株，而ST78 菌株對呋喃妥因和四環素敏感，其抗生素耐藥性沒有其他兩個型別的嚴重。由此可見分子流行病學研究對VREfm 的防治有重要的意義，臨床需重視高耐藥菌株的流行且要根據藥敏結果選用抗生素，提高抗菌效果。

我院ICU 優勢STs 是ST80，但因菌株數量少尚不能判斷是否有ST80 基因型VREfm 的爆發。ST80 是國外醫院中比較常見的STs［6］，國內近兩年才可查到深圳有該型別的流行［7］。廣州和深圳經濟和人員往來頻繁，由此推測ST80 可能存在相鄰城市間傳播流行，這與北京、杭州等城市的VREfm 流行情況有差異，因此我國南方地區在控制VREfm 的傳播流行和治療上需要尋找更有針對性的對策。我院ICU 分離的VREfm 均屬于克隆復合體（CC）17，這個復合群是醫院內傳播的主要克隆群［8］，這與國內外相關文獻描述的一致。MLST 聚類分析結果提示可能存在同一醫院的同一病房或不同病房之間循環克隆傳播，必須予以高度關注。

我們的研究分析了近兩年ICU 住院患者VREfm 的攜帶/感染情況，發現了國內較少見的ST80 型別VREfm 的流行，為研究整個南方地區VREfm 流行和防控提供重要參考。