CRMP2對七氟醚誘導的發育大鼠遠期記憶功能障礙的影響

黃澤琪 張昆

七氟醚（sevoflurane，Sev）是嬰兒最常用的揮發性麻醉劑之一。隨著兒科手術數量和類型的增加，早期和重復暴露于七氟醚的情況迅速增加。許多研究表明，發育中的大腦暴露于七氟醚會導致成年期長期神經認知障礙和學習障礙［1］。最近研究發現，嬰兒期的靈長類動物暴露于七氟醚可引起海馬CA1 區突觸超微結構變化，引起長期行為缺陷［2］。此外，臨床報告表明，接受麻醉的嬰兒表現出長期行為和記憶障礙，這些缺陷與突觸功能和神經元回路的紊亂有關［3］。

CRMP2（collapsin response mediator protein 2，CRMP2）為崩塌反應調節蛋白2，主要在神經系統中表達，在神經元極性建立和軸突導向中起重要作用。神經元極化是神經元的小突起分化成軸突和樹突的階段，增加CRMP2 的表達能夠改變海馬神經元的極化，并在神經元中誘導多軸突［4］。同時，CRMP2 活性受到磷酸化狀態的精確調控。有研究發現，在自身免疫性腦脊髓炎（EAE）動物模型中，在EAE 的發作高峰期，病變周圍的軸突中磷酸化的CRMP2 增加［5］。在前期實驗中，我們發現七氟醚能夠引起CRMP2 不同位點的磷酸化引起神經發育異常。但CRMP2 是否為七氟醚誘導神經毒性途徑的確切靶點，目前尚未可知。

因此，本研究擬采用海馬定位注射技術，調控SD 幼鼠海馬CRMP2 的表達，研究CRMP2 在七氟醚所致發育大鼠遠期記憶功能障礙的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑SD 大鼠七氟醚暴露密封裝置，電熱恒溫水浴箱（北京市永光明醫療儀器廠），冰凍切片機（Leica），微量注射器（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），熒光顯微鏡Leica DMi8（Germany），七氟醚（雅培有限公司），野生型CRMP2 腺病毒（WT-CRMP2）（和元生物技術（上海）股份有限公司），CRMP2 抗體（CST）；β-actin 抗體（Santa Cruz）。

1.2 動物與分組出生3 天的SD 幼鼠（postnatal day 3，P3）購自南方醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2016-0041。本實驗經過中山大學動物倫理委員會批準，倫理批件編號：SYSU-IACUC-2023-000306

1.2.1 SD 幼鼠海馬定位注射 8 只P5 幼鼠通過微量注射器將2 ul 臺盼藍稀釋液通過海馬體表定位進行注射染色，10 min 后處死取出大腦組織，切片顯微鏡觀察臺盼藍注射位置。

1.2.2 海馬轉染WT-CRMP2 腺病毒效率 6 只P5幼鼠隨機分成WT-NC 組和WT-CRMP2 組，將WTNC 和帶有熒光蛋白GFP 的WT-CRMP2 腺病毒稀釋成1.0×109，將2 ul 病毒注射進海馬區，3 天后處死，部分取海馬組織行Western-blot 檢測CRMP2 表達，部分取大腦組織切片，熒光顯微鏡下觀察感染率。

1.2.3 場景恐懼記憶實驗分組 30 只P5 幼鼠隨機分別為Air+WT-NC 組，Sev+WT-NC 組，Sev+WTCRMP2 組，腺病毒注射后養至P7，進行air 或Sev暴露4 h，P31-P32 進行情景恐懼實驗。

1.3 方法（1）SD 幼鼠海馬定位注射位置的確定將臺盼藍溶于4%生理鹽水中，過濾待用。P5 幼鼠用高濃度Sev 迅速麻醉后，用微量注射器從前囟向后2-3 mm，向左或向右1-2 mm，深度1-2 mm，注射2 ul 臺盼藍溶液染色，注射后密切觀察幼鼠的呼吸、皮膚顏色等生命體征。（2）幼鼠Sev 暴露模型建立根據實驗分組，將Sev 組幼鼠置于密封箱中，經氧氣將Sev 輸送至密封箱中，氣體檢測儀監測Sev、O2和CO2濃度，維持2.8%的Sev 濃度。air 組幼鼠置于另一玻璃箱，通入空氣。兩組動物玻璃箱均置于36℃水浴箱中，暴露4 小時。

1.4 Western blot 檢測蛋白的表達海馬定位注射3 天后將幼鼠處死，冰上分離幼鼠大腦海馬組織，加入裂解液勻漿后提取蛋白，BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度并調平各組蛋白濃度，行電泳、轉膜、封閉，加入CRMP2 和β-actin 抗體。

1.5 組織冰凍切片SD 幼鼠大腦海馬腺病毒注射后3 天后處死，取大腦組織固定、漂洗和脫水后，放入OCT 包埋劑中冷凍和保存，切片機切取大腦組織，熒光顯微鏡下通過綠色熒光蛋白觀察腺病毒表達情況。

1.6 場景恐懼記憶實驗將P31 大鼠放置于帶有電擊的試驗箱中，適應120 秒后，分別在120 秒、180 秒、240 秒、300 秒和360 秒時對大鼠進行白噪音刺激（2000Hz；90dB），持續30 s，并在聲音刺激最后2s 同時給予持續2 s 的足部電擊（1mA），以建立恐懼記憶模型。實驗結束后讓動物在實驗箱內繼續停留2 分鐘后放回飼養籠飼養。24 h 后將大鼠放回實驗箱，記錄大鼠木僵時間（8 min）。

1.7 統計學處理用GraphPad 9 統計軟件分析，數據用均數±標準差（mean±SD）表示。用單因素方差分析（one-way ANOVA）對多個組均數間進行比較，并采用Turkey 檢驗對各組行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 確定SD 幼鼠海馬定位注射位置以幼鼠頭部前囟為原點，向左或向右偏1 mm，向后2.5 mm，進針2 mm，行海馬定位注射臺盼藍溶液染色，大體解剖可見海馬區有臺盼藍溶液。冰凍切片顯微鏡下見海馬區有穿刺孔徑，孔徑附近有臺盼藍染料（圖1）。

圖1 A、B 分別為×0、×40 倍數下的大腦組織切片

2.2 WT-CRMP2 腺病毒轉染效率與對照組相比，WT-CRMP2 組CRMP2 的表達未有統計學意義（圖2）。免疫熒光結果顯示，對照組無法檢測到綠色熒光。WT-CRMP2 組中海馬和大腦皮質區均檢測到綠色熒光（圖3），表明大腦皮質和海馬均感染了腺病毒，并成功表達了CRMP2。

圖2 病毒轉染后Western-Blot 的檢測結果

圖3 病毒轉染后免疫熒光的檢測結果（×0）

2.3 WT-CRMP2 腺病毒對七氟醚誘導的大鼠恐懼實驗的影響在恐懼實驗訓練中，大鼠在每個時間段的“木僵”時間逐漸增加，且大鼠在各個階段的“木僵”時間百分比相近，未有統計學差異（圖4 A）。24 h 后行記憶檢測，與Air+WT-NC 組相比，Sev+WT-NC 組的大鼠“木僵”時間明顯降低（P＜0.001）。與Sev+WT-NC 組相比，Sev+WT-CRMP2 組大鼠“木僵”時間明顯恢復（P＜0.01）（圖4 B）。

圖4 A 每個訓練階段木僵時間的百分比；B 記憶檢測時木僵時間的百分比；**P＜0.01；***P＜0.001。

3 討 論

3.1 大鼠海馬成功轉染腺病毒并表達了CRMP2海馬位于大腦丘腦和內側顳葉之間，是參與學習和記憶的重要腦區。同時，海馬在體表的位置較易定位，本研究通過臺盼藍染料顯示了海馬在體表的定位，后續通過此定位進行病毒轉染實驗。由于腺病毒轉染效率高，表達穩定，轉染3-4 天表達達到高峰，因此，本研究選擇腺病毒進行轉染并在表達高峰期檢測CRMP2 表達，結果沒有明顯變化?？赡苁且驗樵撓俨《編в猩窠浽禺愋?syn 序列，無法感染除神經元以外的細胞。且提取的蛋白不僅有神經元，還有大量的神經膠質細胞。為了進一步驗證感染效率，我們構建了帶有-GFP 序列的WT-CRMP2 腺病毒，免疫熒光結果顯示海馬和皮質均有綠色熒光，說明腺病毒成功轉染海馬并表達了CRMP2。

3.2 促進CRMP2 表達逆轉了七氟醚所致的遠期記憶功能障礙CRMP2 在神經元中參與調節生長錐的動力學以及突觸組裝、神經遞質傳遞和鈣離子穩態等［6］。有研究發現，在海馬神經元中過表達的CRMP2，突觸蛋白表達增多，興奮性突觸后電流振幅和頻率增強，樹突棘形成和成熟增多［7］。Fu 等人發現反復短期七氟醚暴露會導致突觸可塑性相關蛋白表達下降，海馬可塑性功能障礙，引起大鼠學習和記憶能力受損［8］。我們前期的研究發現，七氟醚能夠引起不同位點CRMP2 磷酸化，引起大鼠學習和長期記憶功能損害。與本次研究結果相符，促進CRMP2 的表達改善了七氟醚誘導的大鼠遠期記憶功能障礙，提示七氟醚可能是通過干擾CRMP2 的功能，參與大鼠遠期記憶功能障礙。

綜上所述，本研究通過在新生幼鼠海馬轉染WT-CRMP2 腺病毒，發現七氟醚誘導新生大鼠遠期記憶功能障礙的機制可能與抑制CRMP2 表達有關。