基于2531例宏基因二代測序結果分析惠普爾養障體

汪單蘭 魯小慧 譚妮 蘇夢婷 龔羽婷 何貴*

惠普爾病是一種罕見的傳染病，可表現為腹痛、腹瀉、體重減輕、關節炎等多系統非特異性癥狀，基礎免疫低下或缺陷通常會導致更復雜的臨床表現［1-2］?；萜諣栶B障體（Tropheryma whipplei）是細胞內寄生菌，基因組大小約0.9Mbp；為惠普爾病的病原體，可表現出臨床癥狀，也可表現為無癥狀攜帶者［1，3］。常規的細菌培養、免疫組織化學、PCR 檢測方法不易檢出，很難診斷這種感染。由于感染癥狀的非特異性，該細菌在鑒別診斷中很常見。宏基因二代測序技術（Metagenomic nextgeneration Sequencing，mNGS）經過近10 年的發展，在臨床檢驗醫學中逐漸被認可。相較于常規的病原體檢測方法，mNGS 檢測具有耗時短、能夠同時檢測多種病原體、靈敏度高、特異性好等特點［4］。目前，采用mNGS 技術檢測惠普爾養障體的文獻報道并不多。

1 臨床資料

1.1 一般資料回顧性分析2020 年9 月-2023 年6 月期間在本院進行mNGS 檢測的樣本，共計2531例。樣本采集遵循無菌操作原則。檢測對象年齡范圍為1-100 歲，平均值為（50.73±20.89）歲?；颊叩哪挲g、性別和樣本類型等基本信息從朗伽系統獲取。本研究遵循《赫爾辛基宣言》中的倫理原則，經中山大學孫逸仙紀念醫院醫學倫理委員會批準（SYSKY-2023-806-01）。

1.2 方法（1）宏基因二代測序技術 樣本類型包括肺泡灌洗液、痰液、外周血、腦脊液、胸腹水和組織等。不同類型樣本的前處理方法不完全相同，樣本前處理后提取核酸。通過質控的核酸再片段化、pre-PCR 和PCR 擴增建庫。文庫質控后，再pooling 文庫和上機測序。二代測序使用的平臺為illumina NextSeq 550，采用單端測序方法，讀長75nt 或40nt。（2）宏基因生信分析 測序下機的fastq數據，過濾低質量序列后，使用Burrows-Wheeler 工具與人類參考基因組（hg19）比對，提取未比對上hg19 的序列。將去除宿主序列的數據，通過宏基因組數據庫進行微生物分類注釋。（3）系統發育樹分析mNGS 是全基因測序技術，由mNGS 測序數據分析進化親緣關系時，選用了基于單核苷酸多態性（SNP）的方法構建系統發育樹。首先從fastq數據中提取惠普爾養障體序列，然后用megahit v1.2.9［5］將惠普爾養障體序列拼接成contigs。構建系統發育樹的另外19 株惠普爾養障體基因組序列從NCBI 下載［6］。然后，用snippy v4.4.0 建索引、比對和call SNP 分析，最后用FastTree v2.1.11［7］構建系統發育樹。

1.3 統計方法分類變量用百分比表示。服從正態分布的連續變量用（±s）表示。采用t檢驗或Pearson 檢驗方法進行比較分析。P＜0.05 表示差異具有顯著統計學意義。

2 結 果

在2531 例mNGS 樣本中，共檢測出18 例惠普爾養障體，結果如圖1-A 所示，陽性檢測率為0.71%。其中，呼吸系統來源的mNGS 樣本例數為1090 例，惠普爾養障體陽性檢測率為1.55%（17 例/1090 例），與文獻報道的陽性檢測率相近［8］。圖1-A 中，總reads 指mNGS 測序檢測到的惠普爾養障體序列數；reads 百分數指惠普爾養障體序列數與所測到的細菌或屬總序列數的百分數。t檢驗比較分析惠普爾養障體陰性與陽性患者的年齡有無差異，P值為0.52，無顯著差異，見圖1-B 所示。

圖1 mNGS 對惠普爾養障體的檢測結果

Pearson 檢驗比較分析惠普爾養障體陰性與陽性患者的性別有無差異，計算得χ2為7.57，P值＜0.05，差異顯著，表示女性是惠普爾養障體的易感人群，數據見表1。將mNGS 樣本類型分為呼吸系統來源和其他來源兩大類。其中，呼吸系統來源樣本類型包括肺泡灌洗液、肺組織和痰液，其他來源樣本類型包括外周血、腦脊液、胸腹水等。比較分析惠普爾養障體陰性與陽性結果的樣本類型有無差異，經Pearson 檢驗計算得出χ2為19.51，P值＜0.05，差異顯著，表示惠普爾養障體在呼吸系統易感，數據見表2。表1 和表2 中，小括號內的數值為理論頻數。

表1 惠普爾養障體感染與性別的關系

表2 惠普爾養障體感染與樣本類型的關系

由20 株惠普爾養障體（基因組信息［9］見表3）的基因組序列構建基于SNP 的進化樹分析。其中1 株為本科室mNGS 檢出的惠普爾養障體，命名為Guangzhou1；另外19 株基因組序列從NCBI 下載。構建進化樹序列比對時，選用了基因組完整的Twist 作為參考基因組。構建成的系統發育樹如圖2 所示，包含3 個主要分支，來自中國廣州的Guangzhou1 和來自法國的2 株Slows、Pneumo30 位于系統發育樹的同一個子段內，與法國來源的這2株菌親緣關系更近。有文獻報道深圳來源的惠普爾養障體與來自德國的TW08/27 親緣關系更近［9］；這提示，惠普爾養障體進化親緣關系與地理起源關系不顯著。

表3 株普爾養障體基因組信息

圖2 株普爾養障體進化樹分析

3 討 論

惠普爾養障體屬于放線菌目纖維素單胞菌科養障體屬，是細胞內寄生菌，難以培養檢出。該細菌擴增復制速度非常慢。在2000 年-2020 年期間，文獻中關于該菌的檢測方法主要為PCR 檢測、免疫組織化學；樣本來源于消化系統、心臟、關節、腦等組織，以消化系統為主。近5 年開始出現使用mNGS 檢測惠普爾養障體的文獻報道。

在2023 年7 月3 日以“whipplei mNGS”、“whipplei Metagenomic”為關鍵詞在pubmed 檢索出15 篇文獻，以“惠普爾宏基因”為關鍵詞在知網檢索出8 篇文獻。其中，以呼吸系統樣本為主。我們統計顯示惠普爾養障體在呼吸系統的檢出率高于其他類型樣本。由于消化道標本存在污染其他樣本的高風險，臨床mNGS 不建議用于檢測糞便、肛拭子等消化道樣本。該文章中，消化系統來源的樣本少于10 例，故無法統計消化系統的陽性檢出率情況。

進化樹分析可用于研究菌株之間的系統發育關系，也可以在疾病爆發期間識別病原體的來源。在這項研究中，我們報道了一個Guangzhou1的基因組序列，它是使用宏基因組測序數據組裝而成。另外19 株惠普爾養障體基因組數據從NCBI 下載。我們對這20 株惠普爾養障體的核酸序列進行比對、提取單核苷酸多態性信息后，再構建系統發育樹。研究確定了菌株之間的系統發育關系。并發現，即使是來源于不同地理區域的惠普爾養障體也有密切的發育關系，菌株與其地理起源之間沒有相關性，這與文獻報道一致［9］。

總之，我們使用宏基因組測序技術（mNGS），回顧性分析難以培養檢出的惠普爾養障體的陽性率和檢出率高的好發部位。此外，從中國廣州獲得一個惠普爾養障體基因組組裝contigs 序列，并采用進化樹分析系統發育關系。因此，我們認為mNGS 技術有助于檢測和分析難以培養檢出的微生物。