某化工園區綜合廢水處理單元中病毒群落的分布特征

梅紅， 汪炎， 洪文清， 宋立巖

（1.東華工程科技股份有限公司， 合肥 230024； 2.安徽大學 資源與環境工程學院， 合肥 230601）

污水處理廠（WWTP）一般聯合應用物理、 化學和生物等多種處理方法有效去除污水中污染物。 在污染物分解過程中， 微生物進行生物降解從而有效去除污染物［1-2］。 病毒是一種專門寄生在細胞內的微生物， 它依靠宿主微生物來生存和復制［3］。 在感染周期中， 病毒通過裂解微生物細胞來釋放宿主提供的營養物質， 以及通過轉導和表達病毒基因，重新編程被感染宿主的代謝過程， 從而完成自身的繁殖［4-5］。 同時， 細菌群落作為病毒寄生最多的宿主微生物， 其活動和功能受到病毒的直接調控［4］。環境中病毒的數量通常比微生物數量多10 倍以上，并通過侵染微生物對其群落結果和功能產生直接影響， 間接地對污水處理效果產生顯著影響［6-7］。

隨著宏基因組技術的快速發展， 人們對于病毒群落的組成和多樣性有了更深入的理解［8］。 同時，生物信息分析可以進一步解析病毒群落在環境介質中的演化， 例如線性判別LEfSe 分析可以深入分析不同組間顯著差異的群落特征， 并且已被用作揭示河流、 湖泊和海洋等不同環境中差異微生物群落的工具［9-11］。 這些研究揭示了不同生境中代表性微生物并闡明了差異微生物的主要特征和功能。 然而，在WWTP 各子系統中差異病毒群落發揮何種功能仍鮮為人知。

病毒通過侵染宿主微生物從而對宿主微生物群落結構和功能產生直接影響， 并間接對污水處理效果產生顯著影響， 因此， 研究WWTP 中病毒群落的特征， 及其與宿主的關聯可以為提升WWTP 的污水處理效率提供科學依據。 本文以安徽省某化工園區綜合廢水處理核心單元為研究對象， 采用宏基因組測序和LEfSe 分析， 研究了該WWTP 中原水、厭氧池和污泥池中病毒群落的分布特征及其與細菌群落的相互關系， 闡明WWTP 各子系統中病毒群落分布格局， WWTP 中細菌群落多樣性與病毒群落組成間的關系， 以及WWTP 各子系統中病毒群落的差異， 旨在通過調查研究結合生物信息學分析， 揭示WWTP 中病毒群落的分布特征， 明晰宿主（細菌）對病毒群落組成的重要影響作用。 弄清WWTP 中病毒群落分布格局及其發生機制， 這不僅有助于闡明病毒在污水中的分布和遷移規律， 拓展環境微生物學研究范疇， 而且對我國水資源的可持續發展具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 采樣點信息和樣品采集

試驗研究在安徽省某化工園區綜合廢水處理廠（WWTP）內進行， 該WWTP 的日處理水量為1.5 萬t。 WWTP 的工藝流程如圖1 所示， 廢水經澄清池混凝沉淀后進入緩沖池， 出水進入水解池使其可生化性得以改善， 然后經厭氧池厭氧處理后流入好氧生物池進行好氧處理， 最后經過二沉池沉淀后排放。

圖1 WWTP 工藝流程Fig.1 Process flow of WWTP

從WWTP 的進水處（RW）、 厭氧池（IAT）和回流的活性污泥（AS）中分別平行采集了3 份500 mL樣品置于滅菌的超凈HDPE 瓶中， 樣品置于冰上運回實驗室， 并在8 h 內完成預處理， 采用0.22 μm無菌親水膜過濾水樣， 同時以5 000 r／min 離心污泥樣品20 min 并取0.1 g 濃縮污泥。 預處理后的樣品用于DNA 提取。

1.2 理化指標的測定

使用YSI 6600 V2 多參數水質分析儀測量水樣的pH 值， 按標準方法測定水樣的COD、 NH3-N、TN 和TP［12］。

1.3 DNA 提取與宏基因組測序

使用FastDNA Spin Kit（MP Biomedicals， Irvine，CA）提取DNA， 并用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific， USA）定量， 然后用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測［13］。 利用Covaris M220 將DNA 片段化到約400 bp， 最后利用NEXTFLEXTMRapid DNA-Seq Kit 構建PE 文庫。 配對端測序在上海某公司的Illumina HiSeq4000 平臺上進行。

1.4 宏基因組序列數據的處理

首先對原始序列進行拆分、 質量剪切以及去除污染等優化處理， 質控在Fastp v0.20.0 上進行； 然后使用優化序列進行拼接組裝和基因預測， 對得到的基因進行物種和功能上的注釋以及分類， 注釋包括基因物種注釋NR。 病毒的豐度以NR 物種注釋后RPKM 標準化后的絕對豐度表示， 即每百萬條序列中， 每個基因以1 000 個堿基為單位， 比對上的reads 條數。

1.5 統計分析

基于r 3.6.3 和RStudio 1.1.463 軟件， 并利用Spearman 相關性分析檢驗細菌群落豐富度和多樣性與病毒群落相異度的相關性。 通過線性判別（LEfSe）分析甄別了各樣點間的差異病毒， 同時基于非參數Kruskal-Wallis 秩和檢驗與Wilcoxon 秩和檢驗判別了差異病毒的一致性。 在LEfSe 分析中，選定log10（LDA）的值為3.6。

2 結果與討論

2.1 病毒的總體消減特征

COD、 TN 和NH3-N 的濃度 在 經 過WWTP 的子系統運行后得到了有效控制， 各子系統中污染物濃度存在顯著性差異（P ＜0.05）， 同時由于TP 進水濃度較低， 故濃度變化并不規律（表1）。

表1 WWTP 研究單元的水質指標Tab.1 Water quality indicators in research unit of WWTP

WWTP 中各流程病毒豐度如下： 原水124 680±8 112、 厭氧池87 585±11 928、 活性污泥136 988±15 514。 當廢水經水解和厭氧處理后， 厭氧池中病毒濃度相較于進水處下降了29.75%（以均值計算），表明厭氧處理對病毒的去除有一定作用； 污泥池中病毒濃度相較進水處上升了9.87%， 這是因為活性污泥富集了大量微生物成為病毒適宜的宿主。

2.2 病毒群落分布特征

基于宏基因組技術， 本研究在病毒門水平上展示了各樣點中相對豐度為1% 以上的病毒（圖2），通過熱圖展示了相對豐度前50 的病毒屬（圖3）。WWTP 中主要病毒門包含Uroviricota 和Nucleocytoviricota 門， 其在各樣點平均占比為53.42% 和26.10%， 其中Uroviricota 門在活性污泥的樣本中占比68.98%， 而Nucleocytoviricota 門在原水中占比52.59%。 Uroviricota 門可能會影響人體的新陳代謝或免疫系統［14］， 而Nucleocytoviricota 門由于其特殊的構造而只能侵染環境中的真核生物［15］， 同時真核生物會分泌大量干擾素應對病毒的侵染， 但干擾素會對人類的生命健康產生多重影響和作用［16-17］。

圖2 病毒群落在門水平上的組成Fig.2 Viral community composition at phylum level

圖3 病毒群落在屬水平上的組成Fig.3 Composition of viral communities on genus level

在病毒的屬水平上， 各病毒在不同樣點中的分布存在差異。 具體而言， 原水中的Kembevirus、Krylovvirus 和Phikzvirus 屬占比較高， 且在后續流程中相對豐度明顯下降； 厭氧池中相對豐度較高的病毒并不多， 僅Hokovirus 屬最顯著， 這可能是因為厭氧環境中產生能量的途徑急劇減少， 限制了病毒增殖和感染宿主［18］， 同時這解釋了厭氧池中病毒豐度下降了29.75%， 而在活性污泥中Phabquatrovirus、Lightbulbvirus、 Obolenskvirus 和Lanavirus 等病毒屬得到了富集（圖3）。 研究結果表明活性污泥中微生物濃度較高， 改變了物種間的競爭關系， 導致病毒的寄主細胞數量增加， 從而促進了病毒的增殖。

2.3 病毒在各單元中的差異

通過LEfSe 分析對比原水、 厭氧池和活性污泥三者中的差異病毒， 并將log10（LDA）的值設置為3.6， 結果表明， Megaviricetes 綱、 Mimiviridae 科、Myoviridae 科和Mimivirus 屬是原水中差異顯著的病毒。 Hokovirus 屬、 Caudoviricetes 綱、 Caudovirales目和Siphoviridae 科是活性污泥中差異顯著的病毒（圖4）。 原水中多數差異病毒均與肺炎病毒相關，以往研究認為Mimiviridae 科、 Myoviridae 科和Mimivirus 屬可能會引起嚴重的肺炎［19］。 相對而言，活性污泥中的差異病毒繁多， 如Hokovirus 屬是一種豬病毒， 而Siphoviridae 科是感染金黃色葡萄球菌的病毒［20-21］。 總之， 三者間的差異病毒的功能和感染的對象均不同， 表明WWTP 中的病毒群落分布具有空間異質性。 病毒通過侵染特定的宿主微生物進行繁殖， 宿主微生物的組成會直接影響病毒的種類， 因此， 本研究中WWTP 的病毒群落分布空間異質性主要是由于各處理單元宿主微生物種類不同而導致的。 探究不同處理單元中病毒的分布特征可以了解各單元的宿主微生物的組成， 從而可以評估各單元的生物處置效能。

圖4 基于LEfSe 分析的原水、 厭氧池和活性污泥三者間的差異病毒Fig.4 Differential virus among raw water, anaerobic tanks, and activated sludge based on LEfSe analysis

2.4 病毒群落與細菌群落間的關系

基于Mantel 檢驗并利用Spearman 相關性分析， 檢驗了WWTP 中細菌群落多樣性和豐富度與病毒群落的Bray-Curtis 相異度之間的關系。 Bray-Curtis 相異度可以衡量樣本中不同物種組成的數量特征［22］。 在WWTP 中， 隨著細菌群落的豐富度和多樣性增加， 各樣點中病毒群落越來越相似（圖5）， 尤其是細菌群落豐富度與病毒相異性之間的關系更顯著（P=0.000 2， R=0.942）。 當細菌群落豐富度和多樣性增加時， 可能會為病毒提供更多的生態位， 進而增加病毒數量， 并使得各樣點間病毒組成越來越相似。 另一方面， 細菌群落豐富度和多樣性的增加會使得菌落內部競爭加劇， 促進細菌產生更多抗病毒機制， 這將導致某些病毒消失， 從而使各樣點間病毒群落越來越相似。 綜上， 細菌群落豐富度和多樣性的增加導致病毒群落的相似性增加， 這是宿主選擇、 競爭和進化等因素綜合作用的結果。 通過分析細菌群落α 多樣性與病毒間的相關性， 闡明了污水處理過程中病毒群落增殖可能受到宿主（細菌）多樣性調控， 這為污水處理過程的優化提供了一個新的視角， 如何減緩甚至阻斷病毒利用WWTP 中宿主增殖是未來的重要研究課題。

圖5 細菌群落豐富度和多樣性對病毒群落的相關性Fig.5 Correlation of bacterial community richness and diversity with viral communities

3 結論

通過宏基因組測序技術并結合LEfSe 差異分析， 對WWTP 核心單元中病毒群落的分布格局、 差異病毒群落和病毒-細菌間的相關性進行了深入討論。 研究結果表明WWTP 中病毒群落分布具有空間異質性， 并廣泛存在對人體或環境具有危害的病毒群落； 厭氧池的環境會限制病毒增殖和感染宿主，而活性污泥中數量眾多的微生物會促進病毒群落的增殖； 病毒群落的相似性會隨著細菌群落豐富度（P ＜0.05）的增加而增加， 表明病毒對宿主微生物具有直接調控作用以及對污水生物降解效能的間接調控。 本研究為WWTP 中病毒生態學提供了新的視角， 為污水處理效能的提升提供了科學依據。