水飛薊賓對宮頸癌HeLa細胞增殖和侵襲能力的影響及機制研究*

付晴晴, 劉婷婷, 易念華

湖北省婦幼保健院婦女保健科,武漢 430070

宮頸癌是僅次于乳腺癌和結直腸癌的全球第3大女性惡性腫瘤,主要由持續性人乳頭瘤病毒感染引起[1]。目前宮頸癌的治療包括化療、手術和放療,其中以順鉑為基礎的聯合治療是晚期宮頸癌最常用的化療方案[2]。研究發現,多種天然產物對宮頸癌具有較好的療效,其作用機制包括誘導細胞凋亡、抑制血管生成、抑制轉移、降低耐藥性和調節miRNAs等,天然產物可能是新型抗癌藥物的主要候選者[3]。水飛薊賓是從菊科草本植物水飛薊的種子中提取出來的黃酮木質素類化合物,具有抗腫瘤、抑菌、保護心血管等藥理活性[4]。研究顯示,水飛薊賓對人宮頸癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用,其可誘導宮頸癌細胞凋亡,進而抑制宮頸癌裸鼠移植瘤的生長[5-6]。但關于水飛薊賓影響宮頸癌細胞侵襲能力的作用及機制尚未完全明確。細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信號通路參與了宮頸癌的進展[7],抑制ERK/MAPK信號通路可阻斷宮頸癌細胞的遷移、自噬與上皮間質轉化,促進細胞凋亡[8]。為了探究水飛薊賓是否能通過調控ERK/MAPK信號通路影響宮頸癌細胞的侵襲能力,本研究采用不同濃度水飛薊賓干預宮頸癌細胞,檢測其增殖、侵襲能力以及ERK/MAPK信號通路蛋白表達變化,以期為宮頸癌抗癌藥物研發提供一定的數據資料。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人宮頸癌細胞HeLa源自中科院細胞庫。主要試劑:MEM培養液、胎牛血清購自Gibco公司(貨號:c11095500bt、10270-106),PBS、0.25%胰蛋白酶、CCK-8、結晶紫染液購自Solarbio公司(貨號:P1010、T1350、CA1210、C8470),水飛薊賓購自阿拉丁公司(貨號:S109808;純度:98%),順鉑、甲醛、氯仿、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司(貨號:SP439401、10010018、10006818、80109218、10009218),ERK1/2信號抑制劑PD98059、p38 MAPK抑制劑SB202190購自美國MCE公司(貨號:HY-12028、HY-10295),Matrigel膠購自BD公司(貨號:354230),Trizol購自Ambion公司(貨號:15596026),反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司(貨號:2690A),SYBR FAST qPCR Master Mix購自KAPA Biosystems公司(貨號:KM4101),兔抗基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)抗體、兔抗MMP-9抗體、兔抗ERK1/2抗體、兔抗p38抗體、兔抗GAPDH抗體購自Bioswamp公司(貨號:PAB30618、PAB30102、PAB43936、PAB38871、PAB36269),兔抗p-ERK1/2抗體、兔抗p-p38抗體購自Abcom公司(貨號:ab184699、ab195049)。

1.2 CCK-8法檢測細胞增殖

將HeLa細胞復蘇后培養于含10%胎牛血清的MEM中,調整細胞密度,接種于96孔板中,每孔3×103個細胞,100 μL,培養過夜,使細胞貼壁。采用0、25、50、100、200、400、800、1000 μmol/L水飛薊賓處理細胞[9],繼續培養24 h,取出細胞培養板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續培養4 h。于酶標儀中檢測450 nm處各孔的吸光度值(A),并計算細胞增殖率=(A藥物孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)×100%。

1.3 細胞分組與處理

將HeLa細胞分為對照組、水飛薊賓低劑量組(SB-L)、水飛薊賓中劑量組(SB-M)、水飛薊賓高劑量組(SB-H)、PD98059組、SB202190組、PD98059+SB組、SB202190+SB組和順鉑組。對照組細胞采用正常的培養液進行培養,低、中、高劑量組采用含有25、50、100 μmol/L水飛薊賓的培養液進行培養,PD98059組采用含有30 μmol/L PD98059的培養液培養[10],SB202190組采用含有10 mmol/L PD98059的培養液培養[11],PD98059+SB組采用含有30 μmol/L PD98059和50 μmol/L水飛薊賓的培養液培養,SB202190+SB組采用含有10 mmol/L PD98059和50 μmol/L水飛薊賓的培養液培養,順鉑組作為陽性對照,采用含有10 μmol/L順鉑的培養液培養細胞[12],培養24 h后CCK-8檢測細胞增殖。

1.4 Transwell法檢測細胞侵襲

實驗前24 h,對各組細胞進行血清饑餓處理,將細胞培養在不含血清的培養液中。將Transwell小室和24孔板在PBS中浸泡5 min,在Transwell小室中鋪設80 μL Matrigel膠,靜置30 min。收集各組細胞,采用含1%胎牛血清的培養液重懸細胞,調整細胞密度為1×105個細胞/mL,以0.5 mL細胞/小室的比例接種于Transwell小室中,在下層24孔板中加入0.75 mL含10%胎牛血清的培養液,在培養箱中培養48 h。棄去培養板中的培養液,PBS清洗,加入4%甲醛固定20 min。棄去固定液,PBS清洗,加入0.5%結晶紫溶液染色30 min。PBS清洗,晾干,擦去Transwell小室內沒有侵襲的細胞,置于顯微鏡下觀察各組細胞侵襲情況,并計數每個視野中的細胞數。

1.5 實時PCR檢測MMP-2、MMP-9、ERK1/2和p38 mRNA表達水平

取1×106個細胞,加入1 mL Trizol裂解細胞,采用氯仿、異丙醇提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增,引物序列為:MMP-2上游引物為5′-GCTTCCAGGGCACATCC-3′,下游引物為5′-TTGCGGTCATCATCGTAGTT-3′;MMP-9上游引物為5′-GTCCTCGCCCTGAACCTG-3′,下游引物為5′-GGCACAGTAGTGGCCGTAGA-3′;內參基因GAPDH上游引物為5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,下游引物為5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。以2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.6 Western blot檢測MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38蛋白表達水平

取1×106個細胞,加入200 μL細胞裂解液于4 ℃中充分裂解細胞,提取細胞蛋白質。蛋白質定量后,沸水浴10 min使蛋白質變性,離心取上清,取20 μg蛋白上樣,進行SDS-PAGE電泳分離。將蛋白轉膜,采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。按比例稀釋一抗(MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p38、p-p38和GAPDH稀釋比1∶1000,p-ERK1/2稀釋比1∶10000),和膜室溫孵育1 h。洗膜,加入二抗,室溫孵育1 h。將膜轉移至暗室中,滴加化學發光液,于全自動化學發光分析儀中檢測,并讀取蛋白條帶灰度值。

1.7 統計學方法

本研究全部實驗均進行3次重復,計量資料采用均數±標準差表示。采用SPSS 23.0進行統計學分析,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 水飛薊賓抑制HeLa細胞增殖

結果見圖1,隨著水飛薊賓干預濃度升高,宮頸癌HeLa細胞的增殖率逐漸降低。當水飛薊賓濃度大于100 μmol/L時,細胞增殖率低于50%,在保證后續檢測實驗正常進行的前提下,并能探討水飛薊賓的量效關系,本研究采用25、50、100 μmol/L作為低、中、高劑量組水飛薊賓的干預濃度。與對照組相比,其余組的細胞增殖率均顯著降低(均P<0.05);與SB-M組相比,PD98059+SB組和SB202190+SB組細胞增殖率進一步降低(均P<0.05)。

A:不同濃度水飛薊賓對HeLa細胞增殖率的影響;B:各組細胞增殖率的比較;與對照組比較,*P<0.05;與SB-M組比較,#P<0.05

2.2 水飛薊賓抑制HeLa細胞侵襲

結果見圖2,與對照組比較,其余各組的侵襲細胞數均顯著減少(均P<0.05);與SB-M組相比,PD98059+SB組和SB202190+SB組侵襲細胞數進一步降低(均P<0.05)。

1:Control;2:SB-L;3:SB-M;4:SB-H;5:PD98059;6:SB202190;7:PD98059+SB;8:SB202190+SB;9:Cisplatin;與對照組比較,*P<0.05;與SB-M組比較,#P<0.05

2.3 水飛薊賓抑制HeLa細胞中MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38 mRNA的表達

結果見圖3,與對照組比較,除水飛薊賓低劑量組外,其余各組HeLa細胞中MMP-2、MMP-9、ERK1/2和p38 mRNA表達量均顯著減少(均P<0.05);與SB-M組比較,PD98059+SB組和SB202190+SB組HeLa細胞中MMP-2、MMP-9、ERK1/2和p38 mRNA表達量均顯著減少(均P<0.05)。

1:Control;2:SB-L;3:SB-M;4:SB-H;5:PD98059;6:SB202190;7:PD98059+SB;8:SB202190+SB;9:Cisplatin;與對照組比較,*P<0.05;與SB-M組比較,#P<0.05

2.4 水飛薊賓抑制HeLa細胞中MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38蛋白的表達

結果見圖4,與對照組比較,除SB-L組外,其余各組HeLa細胞中MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38蛋白相對表達量均顯著減少(均P<0.05);與SB-M組比較,PD98059+SB組和SB202190+SB組HeLa細胞中MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38蛋白相對表達量均顯著減少(均P<0.05)。

1:Control;2:SB-L;3:SB-M;4:SB-H;5:PD98059;6:SB202190;7:PD98059+SB;8:SB202190+SB;9:Cisplatin;與對照組比較,*P<0.05;與SB-M組比較,#P<0.05

3 討論

宮頸癌是全世界范圍內最常見的婦科腫瘤之一,可影響到患者的卵巢、泌尿系統和腸道功能,其治療方法主要包括早期的手術治療和晚期的放、化療[13]。晚期的放、化療對機體產生一定損傷的同時也會增加患者的痛苦,因此嚴重影響患者的身體健康與生活質量[14]。

西醫常規治療方法在宮頸癌治療方面取得了較為顯著的療效,但仍存在一些毒副作用及耐藥等問題,中醫藥在宮頸癌治療中具有明顯優勢,可從整體出發,辨證論治,前景良好[14]。水飛薊賓為水飛薊素的主要生物活性成分[15],是一種天然黃酮類化合物,通過靶向多種分子靶點和途徑,在不同的腫瘤細胞中表現出抗腫瘤作用,如非小細胞肺癌[16]、三陰性乳腺癌[17]和皮膚癌[18]等。水飛薊賓在宮頸癌中同樣也發揮著抗癌作用,體外研究表明水飛薊賓可通過激活Caspase-3/7相關途徑抑制HeLa細胞增殖,并促進凋亡[5];體內研究發現水飛薊賓可抑制裸鼠移植瘤腫瘤組織的生長[6]。You等[19]發現水飛薊賓能夠介導線粒體裂變功能障礙的發生,誘導宮頸癌細胞G2/M細胞周期阻滯。本研究采用不同濃度的水飛薊賓處理宮頸癌HeLa細胞,發現水飛薊賓對HeLa細胞的增殖具有劑量依賴性的抑制作用,該實驗結果與上述水飛薊賓抗腫瘤作用一致。

腫瘤細胞轉移是癌癥患者死亡的主要原因之一,取決于癌細胞侵入原發性腫瘤周圍的細胞外基質并進入血管的能力,MMPs在基質蛋白降解過程中發揮關鍵性作用,阻斷MMPs活性可有效防止癌細胞的侵襲和逃逸[20]。研究發現,水飛薊賓可通過抑制p38 MAPK信號轉導途徑下調MMP-2和MMP-9的表達,從而降低胃癌細胞的侵襲和遷移能力[21]。MAPK信號轉導途徑在癌癥發生發展過程中發揮重要的促進作用[22],MAPK超家族包括ERK1/2、p38和c-Jun氨基末端激酶等,影響著腫瘤細胞的增殖、周期、凋亡及放射敏感性等[23]。研究顯示,水飛薊賓可抑制乳腺癌細胞的生長與侵襲,其機制與抑制ERK激活,降低MMP-9表達有關[24]。本研究發現水飛薊賓對宮頸癌HeLa細胞的侵襲能力具有抑制作用,進一步通過分子實驗檢測,結果顯示水飛薊賓可顯著抑制宮頸癌HeLa細胞中MMP-2、MMP-9的表達以及ERK1/2和p38的磷酸化水平,且隨著水飛薊賓處理濃度的升高,其抑制作用越顯著,呈現出劑量依賴性,提示水飛薊賓抑制HeLa細胞增殖和侵襲可能與ERK/p38 MAPK有關。我們又進一步檢測了ERK1/2信號抑制劑PD98059和p38 MAPK抑制劑SB202190對HeLa細胞增殖和侵襲的影響,結果顯示PD98059和SB202190與水飛薊賓效果相同,均能降低MMP-2、MMP-9、p-ERK1/2和p-p38的表達,且聯合作用較水飛薊賓單獨作用時的效果更顯著,表明水飛薊賓可通過抑制ERK/p38 MAPK信號通路的激活來抑制體外HeLa細胞的增殖和侵襲。

綜上所述,水飛薊賓在體外可抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖,降低細胞侵襲能力,其作用機制可能與抑制ERK/p38 MAPK信號通路的激活,進而下調MMP-2和MMP-9的表達有關。