著絲粒蛋白-F在胰腺導管腺癌中的表達及臨床意義*

李宇陽, 傅培鈴, 鐘國棟, 盧 梅, 王鵬程, 盧輝楠, 陳林鶯△

1福建醫科大學附屬第一醫院病理科,福州 350005 2福建醫科大學附屬第一醫院濱海院區國家區域醫療中心病理科,福州 350212 3福建中醫藥大學附屬第二人民醫院病理科,福州 350003 4福建醫科大學附屬福清市醫院病理科,福清 350399

胰腺導管腺癌(pancreatic ductual adenocarcinoma,PDAC)是一種惡性程度高、預后差的消化系統常見腫瘤[1]。在美國,胰腺導管腺癌致死率居腫瘤中居第4位[2],在中國,胰腺導管腺癌死亡率居第6位,較過去十年增加了9%[3]。由于早期胰腺導管腺癌患者起病隱匿,臨床癥狀不典型,許多患者在確診時已經發展為中、晚期,錯過了最佳治療時機[4]。因此加強對胰腺導管腺癌發展進程的研究,尋找新的有效的預防和治療途徑,可能是降低患者死亡率、提高生存率的關鍵。

著絲粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)是一種分子量為367 kD的核定位蛋白,是著絲粒蛋白家族中最大的成員,在人類自身免疫系統疾病患者的血清中首次被發現[5]。CENPF可參與細胞周期的調控,在G0/G1期表達水平較低,在S期核基質中逐漸積累,在G2/M期表達最多,達到峰值,最后在有絲分裂期完成降解[6]。CENPF缺失會影響動粒的功能,阻礙有絲分裂的完成[7]?，F有研究表明,CENPF與多種腫瘤發生發展密切相關,例如在腎細胞癌[8]、胃癌[9]、甲狀腺乳頭狀癌[10]、惡性黑色素瘤[11]中均存在高表達現象,但CENPF在胰腺導管腺癌中的具體作用尚不清楚。

因此,為探索CENPF在胰腺導管腺癌腫瘤細胞的作用,本研究應用生物信息學和免疫組織化學染色的方法,從信使核糖核酸(messenger RNA)層面以及組織蛋白層面分析CENPF在胰腺導管腺癌中的表達,探討其與PDAC臨床病理特征及預后的關系,為PDAC的防治研究提供更多理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床病例資料

收集2007～2021年間經福建醫科大學附屬第一醫院病理科確診的胰腺導管腺癌手術標本121例,納入標準:①病理診斷為PDAC;②同時獲得成對的癌組織和癌旁組織;③根治性胰十二指腸切除術(保留或不保留幽門)。排除標準:①接受新輔助化療;②無法獲得病理標本。診斷和分期基于美國癌癥聯合委員會(AJCC)第8版。該研究獲得福建醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.2 目的基因篩選

通過美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的微陣列/基因譜的公共數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO),篩選高質量PDAC數據集芯片,運用GEO2R軟件篩選出差異基因(differentially expressed genes,DEGs)數據集(logFC>1或logFC<-1,且P<0.05),利用維恩軟件篩選出表達一致的差異基因(log FC>0的DEG被認為是上調基因,而log FC<0的DEG被認為是下調基因),運用Cytoscape軟件中的STRING軟件構建表達一致的差異基因蛋白相互作用網絡模塊(protein-protein interactions,PPI),并進行可視化分析,運用Cytoscape軟件中的MCODE應用工具,獲得關鍵PPI聚類模塊(MCODE評分>5分的模塊)。通過GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)對關鍵PPI聚類模塊中的基因在胰腺導管腺癌中的表達差異進行分析,綜合對比關鍵基因差異性表達量,聯合中外胰腺導管腺癌基因研究現狀及PPI聚類模塊中的節點值,選出目的基因。

1.3 目的基因在生物信息學中的表達及預后

基于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)及基因型組織表達數據庫(The Genotype-Tissue Expression,GTEx),通過NCBI網絡、GEPIA、Ualcan及Oncomine軟件[THRESHOLD(P-value)<1E-10,THRESHOLD(fold change)> 2]分別分析CENPF在不同癌癥中腫瘤與正常組織表達差異性,;運用Ualcan分析CENPF在胰腺腫瘤與正常組織表達差異性;運用TIMER生物信息分析工具及Kaplan-Meier在線生存分析工具,評估目的基因與PDAC間的生存預后相關性。

1.4 目的基因在組織蛋白中的表達及預后

利用甲醛溶液固定癌組織和癌旁組織,制作組織蠟塊,按4 μm的厚度連續切片,目的基因CENPF抗體購自Abcam公司,兔單克隆抗體,克隆號:AB223847(EPR20406),按1∶500稀釋后孵育,操作按說明書進行,采用EnVision兩步法檢測。采用Kaplan-Meier分析法分析目的基因在胰腺導管腺癌中總生存情況(P<0.05),并運用Cox回歸分析法分析腫瘤的獨立預后危險因素(P<0.05)。

1.5 目的基因通路及免疫浸潤分析

運用DAVID數據庫軟件,對PDAC中與目的基因相關的上調及下調基因進行基因本體論(gene ontology,GO)分析,包括分子功能(molecular function,MF)、細胞成分(cellular constituent,CC)、生物過程(biological process,BP)等。在TCGA數據庫中,按照目的基因在胰腺導管腺癌中的表達量中位數值劃分為高表達組和低表達組(FDR-q值<0.05且FWER-P值<0.05),進行相關信號通路分析。運用TIMER生物信息分析工具分析目的基因在胰腺導管腺癌中與免疫浸潤的關系。

1.6 免疫組化結果判讀

根據陽性細胞染色強度得分(無0分,弱陽1分,中等強度2分,強陽3分)及陽性細胞百分比得分(無陽性細胞記0分,<1%記1分,1%～記2分,11%～記3分,34%～記4分,≥67%記5分),將兩得分相加,總得分0判讀為陰性,1～8分判斷為陽性(1～4分判讀為低表達,5～8分判讀為高表達)。每組實驗都附有陽性對照,所有免疫組化結果均由兩名高年資病理醫師評估后作出判斷。

1.7 統計學方法

應用SPSS 21.0軟件進行數據分析。目的基因在胰腺導管腺癌中的表達與臨床病理特征的關系,及其在胰腺導管腺癌與癌旁組織中的表達情況,采用χ2檢驗或者Fisher’s精確概率法檢驗,總生存期采用Kaplan-Meier分析法,單因素分析及多因素分析采用Cox回歸分析法,以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 目的基因篩選

為了篩選目的基因,我們首先通過(GEO)公共數據庫篩選出3個芯片數據集(GSE15471、GSE16515和GSE28735),運用GEO2R軟件聯合維恩圖軟件計算出3個數據集中表達一致的差異基因:上調基因共同表達197個,下調基因共同表達66個(圖1A)。再運用Cytoscape軟件中的STRING應用工具構建出DEGs的蛋白相互作用網絡PPI圖(圖1B),并導入Cytoscape軟件中的MCODE應用工具,對PPI網絡進行聚類分析,共獲得2個關鍵聚類模塊(圖1C),共32個基因。最后運用GEPIA對這些基因在胰腺導管腺癌中的表達差異進行分析,聯合PPI聚類模塊中的節點值及中外胰腺導管腺癌基因研究現狀,篩選出目的基因CENPF:該基因屬于DESs中的上調基因,在PPI關鍵聚類模塊得分5.2分,且在胰腺導管腺癌和正常胰腺組織中表達存在差異(P<0.05)(圖1D)。

A:維恩圖顯示上調一致基因、下調一致基因;B:表達一致的上調基因與下調基因PPI交互作用圖;C:PPI交互作用關鍵模塊MCODE得分5.7及5.2分;D:GEPIA軟件顯示CENPF在胰腺導管腺癌與正常胰腺組織中存在表達差異,N(正常)=171例,T(腫瘤)=179例,*P<0.05

2.2 CENPF的表達在不同癌種中存在差異

為了驗證目的基因在腫瘤中的表達是否存在差異,我們運用生物信息學檢測了CENPF在泛癌種中的表達情況。NCBI顯示CENPF在27種人體組織中表達,其中在正常胰腺組織中表達極低(數據來自BioProject,PRJEB4337)(圖2A),GEPIA、Ualcan及Oncomine在線分析工具顯示CENPF在多種腫瘤癌與非癌組系中的表達存在差異(圖2B～2D),其中均包括PDAC。

A:NCBI顯示CENPF在27種人體組織的正常胰腺組織中表達極低(BioProject:PRJEB4337);B:Ualcan顯示CENPF在不同腫瘤中表達不同,紅色代表CENPF在腫瘤組織中的表達,藍色代表在正常組織中的表達;C:CENPF在GEPIA中的表達,紅色字體代表CENPF在腫瘤組織中的高表達,綠色字體代表其低表達;D:Oncomine顯示CENPF在不同腫瘤中的表達,紅色方塊代表CENPF在腫瘤組織中的高表達,而藍色方塊代表其低表達,數字代表相關數據集的數量

2.3 CENPF的表達在癌組織及癌旁組織中存在差異且與不良預后顯著相關

為進一步證實目的基因篩選的可靠性,我們從mRNA層面運用多個生物信息學方法探究其在PADC中的表達及與預后的相關性。Ualcan軟件(按照目的基因在胰腺導管腺癌中表達量最佳截點值劃分為高表達組和低表達組)分析顯示CENPF的表達與PDAC分級存在相關性(P<0.05),并與其不良預后有關(P=0.0038)(圖3A、3B),TCGA數據庫也證實CENPF高表達是患者預后不良的因素(P<0.05)(圖3C),TIMER數據庫表明CENPF高表達與PDAC患者較差的總生存期(OS)相關(P=0.0088)(圖3D),GEPIA顯示CENPF與患者的OS及無疾病進展生存期(DFS)相關(P=0.013、P=0.027)(圖3E、3F)。Kaplan-Meier生存分析結果也顯示CENPF高表達狀態與患者OS以及DFS相關(P=0.00014、P=0.0043)(圖3G、3H)。

A～B:Ualcan分析中CENPF的過表達與分級存在相關性(P<0.05)并與不良預后有關(P=0.00038);C:TCGA數據庫顯示在胰腺癌中高表達與低表達預后存在統計學意義(P<0.05);D:TIMER數據庫表明高CENPF表達與PDAC患者較差OS相關(P=0.0088);E～F:GEPIA顯示CENPF與患者的OS以及DFS相關(P=0.013、P=0.0027);G～H:Kaplan-Meier生存分析結果也顯示CENPF高表達狀態與患者OS以及DFS相關(P=0.00014、P=0.0043)

2.4 CENPF的表達與臨床病理特征的相關性

為進一步驗證CENPF表達失調與PDAC表達存在相關性,通過免疫組織化學法染色,發現CENPF陽性染色定位于腫瘤細胞核,在正常胰腺腺泡上皮和胰腺導管上皮中多呈弱或無陽性著色,且隨著胰腺導管腺癌分化程度的降低,免疫組化顯色度越強且表達陽性細胞數量越多(圖4A～4D)。結合患者臨床資料,經過統計學軟件分析發現:CENPF表達與出現神經侵犯(P=0.036)、更高的TNM分期(P=0.041)、更多的淋巴結轉移(P=0.023)及更差的腫瘤分化(P=0.020)有關;而CENPF在胰腺導管腺癌中的表達與患者性別、年齡、部位、腫瘤直徑、脈管侵犯無關(表1,圖4E～4G)。

表1 CENPF蛋白表達與胰腺導管腺癌臨床病理特征的關系(例)

A:正常胰腺導管上皮表達陰性;B:高分化胰腺導管腺癌;C:中分化胰腺導管腺癌;D:低分化胰腺導管腺癌;E～F:CENPF在淋巴結轉移和伴有神經侵犯的患者中表達更高;G:CENPF與患者總體生存預后關系

2.5 CENPF的表達與PDAC患者預后

為了分析CENPF表達失調與PDAC預后存在相關性,我們運用Kaplan-Meier法分析發現,CENPF高表達的患者預后較差,低表達CENPF組和高表達CENPF組的中位生存時間分別為21個月和9個月(Logrank=18.608,P=0.000016)。單因素分析表明,較差的OS患者與CENPF高表達狀態(P<0.01)、分化程度(P<0.01)、腫瘤部位(P=0.035)、TNM分期(P=0.038)有關。我們將單因素分析P<0.05的指標及卡方檢驗P<0.05的指標納入Cox多變量分析模型,結果顯示:CENPF表達量、TNM分期及分化程度是PDAC患者預后的獨立危險因素(分別為P=0.004、P=0.003和P<0.001),高表達患者的死亡風險是低表達患者的2.65倍(表2)。

表2 胰腺導管腺癌患者總生存率的多因素及單因素Cox分析

2.6 目的基因通路分析及免疫浸潤

為了探究目的基因在PDAC疾病發展中的作用,我們運用DAVID數據庫軟件分析發現CENPF與所在關鍵模塊基因在胰腺導管腺癌中的相互作用,在細胞成分(CC)上,主要富集于外泌體、細胞外基質、細胞質膜、細胞中間體等;在分子功能(MF)上,主要與絲氨酸內肽酶活性、金屬肽鏈內切酶活性、蛋白質同源二聚化活性有關;在生物過程(BP)上,體現在細胞外基質分解抗體、蛋白質水解、半橋粒組裝、細胞粘附等(圖5A)。KEGG富集軟件發現CENPF在胰腺導管腺癌中與細胞周期、P53通路、泛素介導的蛋白水解通路、錯配修復通路以及核苷酸切除修復通路等密切相關(圖5B)。運用TIMER軟件分析發現CENPF與P53呈正相關(P<0.01),與MDM2蛋白呈正相關(P<0.01)(圖5C),并且MDM2在PDAC及正常組織中的表達存在顯著差異(P<0.01)。

A:DAVID分析CENPF與其所在關鍵模塊基因本體論(GO)結果;B:KEGG分析CENPF在胰腺導管腺癌中的作用通路;C:CENPF與P53、MDM2在PDAC中的表達存在相關性;D:TIMER數據庫顯示在PDAC中CENPF與浸潤免疫細胞之間的相關性,CENPF表達與CD4+T細胞(P=0.000204)、樹突細胞(P=0.045)的浸潤密切相關

由于上述研究發現CENPF與所在關鍵模塊基因在PDAC中的作用可能與細胞外基質有關,而細胞外基質與免疫浸潤細胞密不可分[12],我們進一步分析了CNPFF在PDAC中與免疫浸潤細胞的關系。TIMER數據庫分析顯示CENPF表達與CD4+T細胞呈負相關(P=0.000204)、與樹突細胞呈正相關(P=0.045),但與B細胞、CD8+T細胞和巨噬細胞、中性粒細胞無關(圖5D)。

3 討論

胰腺導管腺癌的發病機理是一個復雜的過程[13],Long等[14]綜合運用二代測序、轉錄組Meta分析、免疫組織化學及TCGA微陣列數據方法,發現有23種基因標志物可能用于胰腺癌的診斷和管理。Zhou等[15]對36例胰腺腫瘤進行共表達分析,結果顯示10種樞紐基因可能存在異常表達,其中包括CENPF,由此可見,胰腺導管腺癌是多種因素導致的異質性疾病。本研究基于生物信息學技術,在RNA層面通過微列陣/基因譜數據庫(GEO)篩選出目標基因CENPF。

我們通過NCBI、GEPIA、Ualcan及Oncomine生物信息學分析發現CENPF可在不同類型腫瘤中表達,且在癌與正常組織的表達存在差異,并且Ualcan分析顯示CENPF過表達與PDAC分級存在相關性。截至目前也有眾多學者證實CENPF高表達現象在其他腫瘤中的作用:在肺癌中,CENPF表達上調與患者的預后呈反比,并且敲低CENPF可以抑制肺癌細胞的增殖并促進了其凋亡[16];在肝細胞癌中,CENPF異常表達與有無家族病史、飲酒史、腫瘤分期、是否感染過肝炎病毒等有關[17];在蛋白水平上,我們通過收集121例胰腺癌患者標本,發現CENPF在PDAC表達量顯著多于正常胰腺組,并且隨著PDAC分化程度的降低,免疫組化顯色度越強且表達陽性細胞數量越多。經過統計學分析顯示CENPF的表達與PDAC的TNM分期成正比,與腫瘤分化程度成反比,并且CENPF高表達狀態更易發生神經侵犯以及淋巴結轉移,以上說明CENPF在PDAC的發生發展有關鍵作用,其過表達狀態極有可能影響腫瘤細胞增殖,加速局部擴散,加快惡變進程。

為了更好的認識CENPF過表達在PDAC中的作用,我們進一步探究其對預后的影響,發現CENPF過表達與預后不良有關,并且增加了復發風險,TCGA數據顯示CENPF是患者預后不良的因素,TIMER分析表明高CENPF表達與PDAC患者較差OS相關,GEPIA數據及Kaplan-Meier生存分析結果均顯示CENPF不僅與患者的OS相關,并且是PDAC中DFS的負面因素。我們的組織蛋白實驗數據也顯示CENPF高表達的患者預后較差,低CENPF組和高CENPF組的中位生存時間分別為21個月和9個月,CENPF是PDAC患者預后的獨立危險因素。因此,我們認為CENPF可能有助于預測PDAC患者的預后,是影響PDAC患者的高危風險因素之一,CENPF或許可用作評估風險分層的指標。

近年來,已有學者證實胰腺導管腺癌部分致病通路,比如CDK1基因通過在G2/M期刺激細胞周期進程,導致潛在致瘤突變細胞增殖,并促進癌癥干細胞的發展,從而導致胰腺導管腺癌的發生[18];SMAD4基因突變可以通過誘導糖酵解酶PGK1的上調從而破壞糖酵解水平,導致胰腺導管腺癌的發生等[19]。但CENPF表達失調在胰腺導管腺癌中的致病機制尚未明確。在我們的研究中,發現CENPF所在的關鍵模塊基因在胰腺導管腺癌相互協同作用,主要出現在細胞外機制、外泌體等,與絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸水解酶活性、蛋白質同源二聚化活性有關;并且在細胞外基質分解抗體、蛋白質水解等過程中發揮作用。而CENPF在PDAC中的作用通路,主要參與了細胞周期、P53、泛素介導的蛋白水解等通路過程,研究表明CENPF作為著絲粒蛋白家族最大的基因,能調控細胞周期和改變細胞增殖能力,在有絲分裂過程中表達異常會影響動粒的功能,阻礙有絲分裂的完成?，F有研究已證實在腎上腺皮質癌[20],CENPF的高表達水平與患者OS和PFS的惡化密切相關,可能是通過調節有絲分裂細胞的G2/M期的染色體分離來發揮作用。我們通過TIMER數據庫還發現CENPF的表達與P53、MDM2蛋白均呈正相關,并且MDM2在PDAC及正常組織中的表達存在顯著差異,P53是一種抑癌基因,可在50%以上的腫瘤中發生突變,大多數突變位于DNA結合結構域內,通過降低轉錄活性,導致細胞周期停滯或細胞凋亡[21]。已知P53信號轉導途徑參與調控的基因超過160種,其中報道最多的是MDM2蛋白,MDM2蛋白作為一種環指蛋白,是P53的轉錄靶點,可通過抑制轉錄共激活因子與P53結合影響轉錄活性,從而產生調節DNA修復和細胞增殖的相反反應[22]。所以CENPF過表達在PDAC中的作用,可能與P53-MDM2通路有關,但其精準調節作用,仍需更多實驗進一步證實。

近年來,癌癥與免疫系統的關系受到廣泛關注。CD4+細胞是一種T淋巴細胞表面糖蛋白,可與HLA-Ⅱ分子結合,表達于抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells,APC)表面,可被激活為輔助性T細胞識別外源性抗原。已有研究表明[23]在癌癥患者中,CD4+T細胞可能具有更廣泛的抗腫瘤反應調節,在免疫監視中起到關鍵作用,高密度的腫瘤浸潤CD4+T細胞與許多癌癥類型的良好預后相關。樹突狀細胞(dendritic cell,DC)被認為是有效的APC,在先天性和適應性免疫應答的誘導和調節中起關鍵作用。Kohli等[24]發現漿細胞樣DC(plasmacytoid dendritic cell,pDC)具有持續合成、泛素化和翻轉MHCⅡ-肽復合物的潛力,可誘導調節性T細胞(regulatory cell,Treg)產生外周耐受,并導致同源CD4+T細胞的增殖失敗。Liu等[25]的實驗發現胃癌患者的pDC細胞數量增加,并且在晚期和淋巴結轉移的患者中顯著富集。本文運用TIMER數據庫也發現CENPF過表達與CD4+T細胞呈負相關,與DC細胞呈正相關,在前期的蛋白實驗中我們已證實CENPF過表達與PDAC低分化、高TNM分期及淋巴結轉移有關,說明在PDAC中,CENPF的表達聯合免疫細胞浸潤可能促進腫瘤細胞的進展和轉移:CENPF過表達可能抑制CD4+T細胞的表達,產生免疫逃逸,導致其無法或減弱對腫瘤特異性抗原的識別,并且促進了DC的合成,通過募集更多的Treg細胞來促進PDAC的免疫抑制,反向作用于自身免疫系統,并進一步抑制CD4+T細胞的增殖,導致腫瘤惡化。目前,部分PDAC患者會對化療藥物產生抗藥性,因此針對腫瘤免疫浸潤細胞尋找有效的治療靶點,提供更多的治療方案,有望提高PDAC患者的療效。

綜上所述,CENPF基因在胰腺導管腺癌組織中表達增高,可能與PDAC疾病進展進程有關,攜帶CENPF過表達的患者預后差。尋找胰腺導管腺癌診斷及預后生物學標記物是胰腺癌防治研究的關鍵,通過本項目的研究有望為臨床胰腺導管腺癌的診斷提供了新的思路,也為胰腺導管腺癌的防治提供更多實驗基礎。