線粒體調控在阿爾茨海默病鐵死亡中的作用研究進展*

孟煒寒, 杜 悅, 朱 樂, 曾 燕, 魏 珍,2△

武漢科技大學 1腦科學先進技術研究院 2職業危害識別與控制湖北省重點實驗室,武漢 430065

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以漸進性認知功能喪失和行為損害為主要特征的中樞神經系統退行性疾病,是最為常見的癡呆類型,約占70%[1]。目前,全球約有5000萬AD患者,到2050年將達到1.52億[2]。高齡是AD的主要危險因素,然而AD患病已逐漸年輕化[3],有病例報道最年輕的AD確診患者為19歲[4]。阿爾茨海默病的主要臨床癥狀表現為記憶困難,學習障礙以及精神疾病樣行為(如抑郁、易怒、妄想等),病情嚴重者可能出現癱瘓,生活不能自理[5],給患者家庭以及社會帶來巨大的精神壓力和經濟負擔。阿爾茨海默病的發生發展極為復雜,涉及APP蛋白的異常剪切、Tau蛋白的過度磷酸化修飾、ApoE4基因多態性、膠質細胞促發的免疫炎癥、微生物感染、睡眠、年齡以及社會環境因素(比如受教育程度)等,至今未能清晰解釋AD的發生機制,當然也無有效治療藥物[6]。

隨著研究的深入,除了經典的淀粉樣蛋白級聯假說,近年來一些新的AD致病假說被提出,例如線粒體級聯假說[7],金屬離子紊亂假說[8],腦腸軸假說[9]等。線粒體結構和功能變化可能造成神經元鐵死亡(ferroptosis)是AD致病機制中的重要一環,本文主要綜述了細胞中鐵代謝以及線粒體內脂代謝、氨基酸代謝異常在AD神經元鐵死亡中的作用及機制。

1 鐵死亡的基本特征

鐵死亡(ferroptosis)是一種具有鐵依賴性的新定義的程序性細胞死亡,且具有脂質依賴性與鐵依賴性[10]。發生鐵死亡的細胞往往出現細胞膜起泡但不破裂,線粒體體積減少、雙層膜密度增加、嵴減少或消失等形態學特征。細胞內鐵離子依賴的活性氧(reactive oxygen species,ROS)過量積累,谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的抗氧化作用減弱,使ROS生成與清除之間的穩態被打破,從而促進細胞膜磷脂過氧化引發細胞發生鐵死亡,而這一過程受到許多基因調控[11]。最近的研究表明,鐵死亡與許多疾病的病理生理過程密切相關,如腫瘤、神經系統疾病、缺血再灌注損傷、腎損傷和血液疾病[12]等。

1.1 鐵死亡的細胞形態

鐵死亡細胞在顯微鏡下呈空的胞質組成的透明圓氣球形[13],細胞膜起泡而不破裂,細胞核大小正常。鐵死亡細胞不具有細胞凋亡的典型特征,不會出現凋亡小體、細胞萎縮和染色質凝集等現象[14],也不會形成自噬小體。它也不具有經典的壞死形態,如細胞器與細胞質的腫脹[11]。而在亞顯微結構上,鐵死亡細胞主要表現出線粒體形態變化,如體積縮小,雙層膜密度增加,線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)斷裂,線粒體脊的正常結構被破壞等[14]。這些形態學特征有助于區分鐵死亡與其他細胞死亡模式,如細胞凋亡、壞死、焦亡和自噬。

1.2 鐵死亡的生化與基因調控過程

鐵死亡關鍵的生化過程即膜脂質過氧化。促進該過程的分子或事件會誘導鐵死亡發生,而抑制或緩解該過程的則阻礙其發生。由于細胞內氧化還原活性二價鐵(Fe2+)數量的增加[15],過量的二價金屬陽離子易發生芬頓反應(Fenton reaction),產生過多氧自由基,使細胞膜上的多不飽和醚磷脂(polyunsaturated ether phospholipids,PUFA-ePLs)過氧化。這一過程受到GPX4調控,GPX4將過氧化脂質(LOOH)轉化為相應的脂質醇(CHO)[16],從而緩解過氧化脂質的積累。GPX4同時消耗細胞內抗氧化儲備還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH),將其轉換成氧化型谷胱甘肽(glutathiol,GSSG),因此,細胞內GSH的可利用率影響GPX4的活性,進而影響過氧化脂質的還原。GSH由半胱氨酸(cysteine,Cys)和谷氨酸(glutamate,Glu)合成,細胞內這兩種氨基酸的濃度受氨基酸逆向轉運系統Xc-(System Xc-)精細調控。系統Xc-是由4F2重亞基和xCT輕亞基組成的異源二聚體,分別由溶質載體-家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)和溶質載體家族3成員2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)基因編碼。線粒體是細胞內ATP的主要產地,也是ROS的主要來源。鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)因子將輔酶Q10(CoQ10)還原為泛醇,從而限制ROS產生和脂質過氧化[17]。

在遺傳學上,細胞鐵死亡是由鐵代謝相關基因如轉鐵蛋白及受體(transferrin/transferrin receptor 1,Tf/TfR1)、鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain,FHC)、鐵轉運蛋白1(ferroportin 1,FPN1),脂質合成和修飾基因如脂質合成?；o酶a合成酶家族成員2(acyl-CoA synthetase long chain family member2,ACSF2)、?；o酶a合成酶長鏈家族成員4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4),以及氧化應激基因如ATP合酶F0復合體C3亞基(ATP synthase F0 complex subunit C3,ATP5G3)、檸檬酸合成酶(citrate synthase,CS)共同驅動的[18]。有研究發現,鐵調節蛋白2(iron-regulatory protein 2,IRP2)轉錄后水平調節鐵代謝基因表達,敲低IRP2將沉默鐵代謝基因的表達。IRPs能結合目標mRNA上的鐵反應元件(iron response element,IRE)從而調節細胞內鐵穩態[19]。當細胞缺鐵時,IRPs與IRE結合的親和力增高,抑制鐵蛋白mRNA的翻譯,同時穩定TfR1 mRNA。當細胞鐵充足時,IRPs與IRE結合的親和力降低,增加鐵蛋白合成并促進TfR1 mRNA降解[20]。

1.3 鐵死亡的局限性

近年來,鐵死亡的作用在越來越多的疾病中被發現,例如癌癥、炎癥、缺血再灌注損傷疾病以及神經系統性疾病等。但在一些疾病的相關研究中,鐵死亡的作用仍具有局限性。在癌癥中,Erastin等藥物誘導的鐵死亡可抑制腫瘤細胞的生長,然而,鐵死亡損傷可以在腫瘤微環境中引發炎癥相關的免疫抑制,從而有利于腫瘤生長。鐵死亡對腫瘤生物學的影響程度尚不清楚,但是一系列研究發現癌基因(例如RAS和TP53)的突變、應激反應途徑(如NFE2 L2信號傳導,自噬和缺氧)、上皮間充質轉化以及激活鐵死亡的治療反應之間存在重要相關性[21]。在神經系統疾病中,鐵死亡在AD、帕金森癥(Parkinson’s disease,PD)以及亨廷頓病(Huntington’s disease,HD)、肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)中都被發現可能發揮重要作用[22]。研究表明,在AD、PD和HD臨床病理中已發現腦鐵積累和脂質過氧化[23];而鐵死亡抑制劑被發現在HD細胞模型以及PD的MPTP小鼠模型中具有保護作用[24];在PD和ALS患者的Ⅰ期臨床試驗中使用抗鐵死亡化合物也有良好的療效[25]。關于鐵死亡與神經退行性疾病的潛在關系得到了越來越多的發掘,但是關于鐵死亡在神經退行性疾病中的具體作用機制尚未得到準確的驗證。

2 AD細胞中鐵穩態失衡且線粒體功能障礙

鐵的代謝是鐵死亡過程中一個重要的調節點,其中許多代謝酶和代謝物已被作為鐵死亡調節劑的靶點?！坝坞x”鐵與過氧化氫易誘發芬頓反應[26],產生大量羥基自由基,發生氧化作用,從而促進細胞內脂質、蛋白質和核酸的過氧化尤其是脂質過氧化并引起細胞鐵死亡。因此,鐵穩態的維持對抵抗細胞死亡十分必要。維持細胞內鐵穩態是一個復雜的過程,依賴于多種鐵代謝相關蛋白的協調。研究發現多種鐵代謝相關蛋白在AD患者和小鼠模型的大腦中異常表達,導致鐵沉積并促進AD進展[27]。Tf及其細胞表面受體TfR1主要負責細胞內鐵的吸收。Trf1循環異?？蓪е律窠浲诵行圆∽儾橛心X鐵沉積的神經性病變(neurodegeneration with brain iron accumulation,NBIA)[28]。細胞內鐵的轉出依賴于FPN,而FPN是目前已知唯一的鐵外輸轉運體。FPN表達減少時會使細胞內二價鐵離子蓄積,引發鐵死亡以及氧化應激,神經元功能受損[29]。在神經元中,淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)連接到FPN并穩定FPN的表達。APP也是一種鐵氧化酶,可以氧化Fe2+為Fe3+并將其移出細胞。二價金屬轉運蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)是另一種重要的鐵吸收蛋白,其過度表達會積累細胞內不穩定的亞鐵達到鐵過載的狀態,導致黑質中鐵的積累和多巴胺能神經元的丟失[30]。鐵蛋白是細胞內主要的鐵儲存蛋白,由FTL1(輕鐵蛋白)和FTH1(重鐵蛋白)組成。鐵蛋白主要調節還原狀態(Fe2+)的活性鐵和氧化狀態(Fe3+)的非活性鐵之間的平衡以保存多余的鐵,防止細胞和組織受到氧化損傷[31]。當細胞內鐵蛋白表達異常,游離鐵含量增多時,會導致細胞內鐵穩態失衡引發鐵死亡。核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)是一種選擇性受體,負責與鐵蛋白結合并將其運輸到溶酶體進行降解并釋放活性鐵(Fe2+),此過程被稱為鐵蛋白吞噬(ferritin phagocytosis)[32]。鐵死亡可以通過鐵蛋白吞噬促進鐵和ROS積累來觸發。當NOCOA4表達下調時,會導致鐵蛋白吞噬現象減少,細胞內游離鐵增加,加速細胞內鐵死亡現象發生(圖1)。一些證據表明,鐵蛋白吞噬介導的鐵死亡是導致神經退行性疾病的關鍵機制之一,破壞鐵蛋白吞噬功能會導致鐵代謝缺陷,可能導致過度氧化應激,導致心腦血管疾病、腫瘤和神經退行性疾病等疾病的發生[33]。在PD相關視網膜變性中,α-突觸核蛋白(α-synuclein)會破壞鐵蛋白吞噬,導致鐵蛋白積聚和視網膜鐵過載[34]。NCOA4也參與了維持神經元內線粒體的穩態平衡和線粒體質量控制,是神經元線粒體健康的重要調節因子之一[35]。例如,右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是一類具有神經保護作用的藥物,可以通過NCOA4介導的鐵蛋白自噬來逆轉甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)誘導的海馬HT4細胞系的神經毒性和炎癥[34]。

在阿爾茨海默病中鐵死亡調控機制主要包括:①線粒體結構破壞或功能障礙會導致ATP產量降低、ROS升高;②脂質氧化的代謝酶活性或表達增加,脂質過氧化增強:③半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸合成GSH受阻,或者GSH利用受阻,抗氧化能力弱;④鐵離子輸入轉運體增加,輸出轉運體減少,導致鐵累積

早在上世紀60年代就有研究者指出有證據表明大腦皮層鐵的積累與AD的發展之間存在關聯。研究者在AD患者腦中中觀察到游離鐵含量升高以及鐵蛋白水平升高,且鐵超負荷與AD的認知能力下降成正比[36]。淀粉樣蛋白β(Aβ)和過度磷酸化tau是AD的兩個病理標志,也可以促進鐵在大腦中的沉積,形成AD發展的惡性循環[37]。AD中存在的APP功能受損可引發細胞內Fe2+和Cu2+水平升高,并減少細胞外Cu2+,從而促進其積累。細胞內Fe2+和Cu2+過量累積會導致ROS增加引起氧化應激。此外,鐵、銅和鋅對Aβ具有較高的結合親和力,可以促進其聚集。增加的神經元鐵、銅和鋅也與Tau蛋白結合并促進NFT的形成。因此,在斑塊和神經纖維纏結(neurofibrillary tangle,NFT)中發現了過量的重金屬[38]。由此可見鐵穩態失衡在AD中已被得到強力的證實。

鐵穩態失衡不僅導致鐵死亡,也是導致線粒體功能障礙的重要因素。通常線粒體功能障礙引起的疾病(如腫瘤、慢性炎癥、神經退行性疾病等)都是由線粒體內自由基產生過多導致的,而鐵穩態失衡則可能導致自由基水平升高,使線粒體受到更多的損傷[39]。例如,鐵穩態失衡會導致ROS增加,ROS可分解線粒體膜上的酶并破壞線粒體膜,導致線粒體膜電位下降[40]。同時,線粒體內的鐵離子還可能與硫基團結合形成自由基,進一步強化氧化應激反應,導致線粒體膜及膜上酶的結構和功能受到破壞,從而引發細胞死亡[41]。因此鐵穩態失衡可能通過增加ROS而加重線粒體功能障礙。線粒體和鈣離子的緊密聯系使其能夠快速的負責很多代謝功能,鈣離子濃度能夠影響線粒體內酶的活性,影響線粒體功能,這個過程稱為線粒體級聯反應(mitochondrial cascade hypothesis)[42]。然而,級聯反應可能會導致神經系統的脆弱性并引起一系列疾病,如阿爾茨海默病[43]。鐵離子的穩態失衡也可能干擾細胞內鈣離子濃度,導致鈣和線粒體之間的相互作用受到影響,從而出現線粒體失控和細胞功能障礙[44]。

總的來說,鐵穩態失衡可能通過多重途徑引起線粒體功能障礙從而調控包括AD在內的多種神經性疾病的發生發展。

3 脂質過氧化與線粒體障礙相互作用促進AD的發生發展

氧化損傷是由于ROS的過度產生和抗氧化劑中和或消除其有害影響的能力失衡造成的。ROS介導的脂質過氧化是導致鐵死亡的關鍵步驟[45]。脂質過氧化鏈式反應的產物具有很高的生物活性破壞力,它能損害DNA、蛋白質和酶的活性,并作為激活信號通路的啟動因子,啟動細胞死亡[46]。而膜磷脂(phospholipids,PLs)的過氧化是引發鐵死亡的直接事件[47],尤其是多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的過氧化[48]。脂質組學研究表明,磷脂酰乙醇胺類膜磷脂上的花生四烯酸和腺苷脫氨酶是鐵死亡過程中發生過氧化的主要PUFAs。PUFAs通過?；o酶A合成酶長鏈家族成員-4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)酯化為PUFA-CoA,然后被溶血磷脂酰膽堿?；D移酶-3(lysophosphatidylcholine acyltransferase3,LPCAT3)修飾,以便整合到細胞膜中才能被氧化并成為鐵死亡信號[49]。因此,ACSL4和LPCAT3是調控鐵死亡的關鍵酶,如果ACSL4和LPCAT3缺失,鐵死亡將會被抑制[50]。此外,脂質過氧化的主要產物4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)可誘導ROS的產生,從而進一步反饋激活脂質過氧化反應和鐵死亡發生,因此4-HNE的增加也被認為是鐵死亡的判斷指標[51]。線粒體通過脂肪酸代謝和谷氨酰胺分解為鐵死亡提供所需的特定脂質前體。此外,在線粒體外產生的脂質過氧化物可通過氧化應激的傳播引起線粒體內脂質過氧化和線粒體損傷,從而破壞線粒體對鐵穩態的調節,最終導致鐵死亡的發生[52]。

許多神經退行性疾病(AD、PD、HD等)的發展已被充分證明與發生過脂質過氧化有關。在AD小鼠和AD患者受損的星形膠質細胞中檢測到脂質過氧化產物4-HNE水平顯著升高[53]。研究表明,Aβ肽可激活NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)引起脂質過氧化,而脂質過氧化產物又促進了APP的加工,從而加劇了Aβ肽的積累[54]。而且AD患者大腦中也存在脂質過氧化產物和Aβ斑塊的位置共存現象并且鐵離子增多導致的ROS升高會導致大量低聚Tau的形成。最新研究指出,腸道微生物群可以通過PUFAs相關的神經炎癥調節阿爾茨海默病病理和認知障礙[55]。研究人員發現,AD患者以及模型小鼠的腸道微生物群明顯增多,其中擬桿菌能增強宿主大腦中促炎性PUFA的代謝并激活小膠質細胞和AD病變[55]。脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)[56]、環氧合酶(cyclooxygenase,COX)[57]、細胞色素c(cytochrome c)[58]是參與脂質過氧化的重要代謝酶,它們均被發現在AD細胞中異常表達或活性增強。例如,AD患者大腦中12/15-脂氧合酶(12/15-LOX)的酶活性顯著增加[59],高活性的12/15-LOX降低了AD模型小鼠的記憶和學習能力?；阼F死亡通路中的脂質過氧化在AD病理進展中的重要作用,一些AD治療藥物的研發靶向此過程。最新研究表明,中藥材紅景天可通過下調TFR1和ACSL4蛋白表達,抑制鐵死亡的發生,從而減少Aβ斑塊的積累并挽救神經元損傷來減緩認知障礙[60]。

脂質過氧化與線粒體功能障礙緊密聯系且相互作用于神經系統疾病。線粒體電子傳遞鏈上的氧化磷酸化過程是大多數哺乳動物細胞內ROS的重要來源。線粒體移植實驗發現含有阿爾茨海默病患者線粒體DNA的細胞系表現出更多的活性氧和自由基的產生[61]。局部過量ROS的產生不僅會導致線粒體損傷,還會促進鐵死亡[62]。細胞內抗氧化機制依賴于線粒體內GSSG與GSH的相互轉換,谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)作為鐵死亡核心調控因子能催化GSH轉換成GSSG,同時伴隨毒性脂質過氧化物(LOOH)轉換成脂質醇(CHO)從而抵抗細胞膜上脂質過氧化反應[16](圖1)。值得注意的是,定位于線粒體內膜的二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase,DHODH)可以通過生成一種自由基捕獲型抗氧化劑(radical trapping antioxidant)CoQH2來阻止脂質過氧化,從而抑制鐵死亡,此過程是GPX4非依賴性的,因此若同時靶向GPX4和DHODH將會提高相關疾病的治療效果[63]。最近多項研究表明轉位于線粒體的缺氧誘導因子(transcription factor hypoxia inducible factor,HIF)也參與線粒體脂質代謝從而調控細胞鐵死亡[64]。AD中磷酸化的Tau蛋白已被證明可以阻止線粒體運輸,導致突觸的能量剝奪和氧化應激,進而導致神經退行性變[65]。減少氧化應激、脂質過氧化和鐵過載,可進一步抑制鐵死亡,從而削弱對海馬神經元和突觸可塑性的損傷,最終恢復認知功能[66]。而且AD病理中發現許多鐵死亡證據,包括鐵積累過多,脂質過氧化物和ROS水平升高,GSH和GPX4水平降低等。

總而言之,脂質過氧化作為鐵死亡與AD病理的共同特征,線粒體在兩者之間的橋梁作用不可忽視,但關于三者之間更加準確的調控機理仍有待研究,未來厘清其中的分子機制有助于探索AD預防和治療的新靶點。

4 線粒體內氨基酸代謝異常誘發AD鐵死亡發生

系統Xc-是磷脂雙分子層中廣泛存在的氨基酸逆向轉運體,是由SLC7A11和SLC3A2兩個亞基組成的異二聚體[67]。系統Xc-分別以1∶1的比例控制細胞內胱氨酸(cystine)和谷氨酸的進出[68]。胱氨酸在細胞中被還原為半胱氨酸(Cysteine,Cys),后者與谷氨酸、甘氨酸形成三肽的GSH(圖1)。抑制Xc-系統活性可以阻礙胱氨酸的吸收從而減少GSH的合成,導致GPX4活性降低和脂氧合酶活化,細胞抗氧化能力下降,脂質活性氧積累,最終發生氧化損傷和鐵死亡[69]。也有報道指出,在NFT的形成過程中,鐵的累積可以通過ROS累積,介導氨基酸作用促進Tau的形成。鐵可以通過形成通過磷酸化氨基酸殘基介導的分子間配位復合物來產生低聚Tau,通過Cys-Cys的結合介導Tau的磷酸化[70]。

線粒體內的氨基酸代謝,也可以產生NADPH等還原物為呼吸鏈氧化磷酸化提供底物以補充ATP生成,為細胞提供能量。研究表明,線粒體功能障礙與氨基酸代謝異常存在密切聯系[71]。例如,精氨酸代謝異?？蓳p害線粒體穩態[72],N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可以拯救胎盤中的線粒體損傷以及鐵死亡[73]。在線粒體內,半胱氨酸剝奪(cysteine deprivation,CD)誘導的鐵死亡需要谷氨酰胺分解(將谷氨酰胺轉化為谷氨酸),通過α-酮戊二酸脫氫酶(alpha-ketoglutarate dehydrogenase,KGDH)復合物促進線粒體內三羧酸循環。KGDH不僅參與谷氨酸水平的調節,還充當氧化還原傳感器以維持線粒體氧化還原狀態[74]。有研究發現,線粒體活性增加會降低γ氨基丁酸的信號傳導會導致社交行為障礙與神經元穩態被打破[75]。GSH作為細胞內的主要抗氧化劑,在線粒體鐵硫(iron-sulfur,FeS)簇生物合成中是必不可少的,通過共價連接FeS簇作為CGFS型(Ⅱ類)戊二醛(glutaredoxins,Grxs)的輔助因子,以幫助FeS前體從線粒體輸出[76]。

越來越多的證據表明GSH的失調可能與神經變性相關聯。AD患者大腦中GSH水平降低[77],血清中Cys的水平顯著降低[78]。低水平的Cys以及GSH會促進AD細胞鐵死亡。而GSH作為抗氧化劑,共同作用于鐵死亡以及AD的病理過程也有大量研究。研究發現,當細胞內GSH降低時,會導致Fe2+轉運受損,進而引發鐵死亡。同時Fe2+轉運受損會導致線粒體功能受損從而可能導致AD的發生[79]。同時低水平的GSH也會造成細胞內其它金屬離子紊亂(例如銅)從而增加神經細胞的死亡[13]。

5 總結與展望

隨著全球AD發病率的逐年攀升,尋找新的有效的藥物靶點迫在眉睫。本文從線粒體調控鐵死亡的病理機制入手,從鐵穩態失調、脂質過氧化以及氨基酸代謝紊亂三個方面展開討論,綜述了線粒體功能障礙調控鐵死亡在AD發病中作用的研究進展,以期為AD尋找更有效的治療方案提供新思路。針對AD鐵死亡的藥物研發目前還處于基礎研究階段,而一些鐵螯合劑已經用于臨床緩解鐵沉積,消除腦內自由基。隨著對AD病理機制的認知加深,未來有望針對多靶點共同調控網絡,并結合中藥復方療法,采用聯合治療方案,為根治AD提供新的可能。