凍融移植周期囊胚自發性皺縮對妊娠結局和新生兒結局的影響*

李 丹, 余 瓊, 劉 群, 任新玲, 靳 鐳

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院生殖醫學中心,武漢 430030

自發性皺縮是囊胚在擴張過程中常見的一種現象,它指的是≥50%的滋養外胚層細胞表面從透明帶的內側自然分離[1],囊腔出現塌陷。自發性皺縮發生的原因尚未可知,其是否影響輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)妊娠結局及新生兒結局的研究也較少。目前胚胎選擇主要依據形態學評估,按照Gardner囊胚評分體系[2]根據囊胚腔擴張程度、內細胞團(inner cell mass,ICM)和滋養層細胞(trophectoderm,TE)的形態和數目對囊胚質量進行分級,該系統并沒有涵蓋囊胚形態的所有方面,有其局限性。本研究通過觀察凍融移植周期囊胚自發性皺縮和妊娠結局之間的關系,探討自發性皺縮是否是影響妊娠結局的預測因素,并可能為胚胎選擇提供新的方法,以改善ART后的妊娠結局。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2018年1月至2020年12月在我院接受單囊胚凍融移植的10120個周期的臨床資料,將移植胚胎為自發性皺縮囊胚的133個周期(皺縮組)作為研究對象,為避免選擇偏倚,傾向性評分匹配(propensity score matching,PSM)優先匹配女方年齡、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、體質量指數(body mass index,BMI)、不孕類型、子宮內膜厚度后獲得133個周期移植胚胎為未皺縮囊胚(未皺縮組),分別比較兩組的妊娠結局和新生兒結局。納入標準:①夫妻雙方染色體核型正常;②單囊胚移植周期;③移植胚胎為自發性皺縮囊胚(圖1)。排除標準:復蘇后激光人工皺縮未完全擴張的胚胎。本研究通過本院醫學倫理委員會批準,所有患者夫妻雙方均了解并知情同意。

左圖所示為皺縮組移植囊胚,右圖箭頭所示為自發性皺縮

1.2 研究方法

1.2.1 囊胚培養及評估 按本中心常規方案促排卵,當有2～3個優勢卵泡直徑≥18 mm時肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)10000 U,36 h后在陰道超聲監測下穿刺取卵。取出卵母細胞后,采用常規體外受精、卵胞漿內單精子顯微注射技術(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)進行受精,受精后將胚胎置于G-1卵裂培養液(Vitrolife,瑞典)中,在37℃,6.0% CO2,5.0% O2,89.0% N2的EmbryoScopeTM延時監測(time-lapse monitoring,TLM)培養箱(Vitrolife,瑞典)中進行體外胚胎培養。16～18 h觀察原核后繼續培養至第3天,根據胚胎卵裂情況,挑選1～2個卵裂期胚胎用于新鮮周期移植或冷凍,剩下的胚胎轉移至G-2(Vitrolife,瑞典)囊胚培養液中繼續培養到第5天(D5)或第6天(D6),將達到冷凍標準的囊胚進行玻璃化冷凍保存,在玻璃化冷凍保存前對完全膨脹的囊胚進行激光人工皺縮。囊胚形態評估按照Gardner囊胚評分體系[2]根據囊胚腔擴張程度分為6期:1期,囊腔出現,囊腔范圍小于胚胎體積的一半;2期,囊腔范圍等于或大于胚胎體積的一半;3期,囊腔占滿胚胎,但未完全擴張;4期,囊腔完全擴張,體積增大,透明帶薄;5期,囊胚正從透明帶(zona pellucida,ZP)孵出;6期,囊胚完全從ZP孵出。再根據ICM和TE的形態和數目對囊胚質量進行分級。ICM分級:細胞數目多,排列緊密為A級;細胞數目少,排列松散為B級;細胞數目很少為C級。TE分級:細胞數目多,結構致密為A級;細胞數目少,排列松散為B級;細胞數目很少為C級。

1.2.2 囊胚冷凍及復蘇程序 本研究所用冷凍液、載桿、復蘇液均購自日本KITAZATO生物制藥有限公司。按照本中心常規步驟進行囊胚冷凍復蘇[3]。復蘇后的囊胚均置入37℃,6.0% CO2,5.0% O2的培養箱培養,2～4 h后觀察囊胚色澤及囊胚腔是否重新擴張,進行移植,囊胚腔重新擴張且形態清晰、光澤明亮的囊胚被認為存活。

1.2.3 妊娠及新生兒結局的評估 囊胚移植后12～14 d進行HCG檢測。著床指囊胚移植4～6周行陰道B超可見到孕囊;臨床妊娠為囊胚移植后至少5周行陰道B超可見孕囊,包括宮外孕;臨床妊娠后12周內無胎心活動為早期流產;活產周期中,滿20周至37周前分娩為早產;出生缺陷是指在出生時或出生以后表現的結構、功能或發育異常。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 兩組間基礎資料的比較

經PSM匹配后得到皺縮組與未皺縮組各133個周期。PSM后兩組的女方年齡、FSH、BMI、不孕類型、子宮內膜厚度等的差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 傾向性評分匹配后兩組間基礎資料的比較[M(P25,P75)]

2.2 移植囊胚出現自發性皺縮現象

觀察胚胎出現自發性皺縮現象,滋養外胚層細胞表面從透明帶的內側自然分離的面積≥50%,囊腔出現塌陷。見圖1。

2.3 兩組的妊娠結局比較

皺縮組活產率明顯低于未皺縮組(30.08%vs.45.86%,P<0.01),皺縮組著床率、臨床妊娠率降低,早期流產率升高,但與未皺縮組差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組妊娠結局比較[n(%)]

2.4 多因素Logistic回歸分析各因素對活產率的影響

對影響母體活產的相關因素進行Logistic回歸分析結果顯示,女方年齡、不孕類型、囊胚是否發生自發性皺縮對活產有顯著影響(均P<0.05),考慮到其它協變量后,囊胚皺縮組與未皺縮組的活產優勢比(odds ratio,OR)為0.54(95%CI:0.32～0.91)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析各因素對活產率的影響

2.5 兩組新生兒一般情況及結局比較

皺縮組和未皺縮組各有1個雙胎妊娠活產周期(2個均為男性雙胎),本研究僅比較兩組間單胎妊娠的新生兒結局。兩組間新生兒出生時天數、出生體重、男性新生兒比例比較,差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表4。兩組活產新生兒中各有2例早產,皺縮組單胎妊娠新生兒有1例出生缺陷,為嬰兒腎上腺增大;未皺縮組單胎妊娠新生兒無出生缺陷。

表4 兩組單胎妊娠新生兒結局比較

3 討論

近年來,隨著社會壓力增大、環境污染加劇以及婦女生育年齡推遲,不孕癥患病率逐年上升[4-5],其中許多人最終需要ART進行治療。ART已經從實驗性程序發展成為一種主流醫學,為世界帶來了700多萬兒童[6]。盡管技術不斷改進,仍然有幾乎一半的患者在接受幾個周期治療后都沒有成功活產[7]。同時由于胚胎著床效率低,移植多個胚胎導致了較高的多胎妊娠率。所以,目前體外受精的主要目標之一就是如何選擇最合適的胚胎移植以提高活產率,同時將多胎妊娠相關的并發癥降到最低。本研究觀察凍融移植周期囊胚自發性皺縮是否影響妊娠結局,期望可以改進胚胎選擇的方法,以改善ART后的妊娠結局。

自發性皺縮是發生在囊胚孵化過程中常見的一種現象,其發生僅需幾秒,可持續1～2 h且可以多次發生。自發性皺縮最早見于哺乳動物的胚胎,Lewis等[8]用延時攝影技術監測體外培養的兔子囊胚8 d,發現囊胚在發育過程中會出現反復收縮和再擴張。Massip等[9-10]在奶牛模型上發現,自發性皺縮影響奶牛囊胚的正常孵化,囊胚在擴張過程中被多次自發性皺縮反復打斷后,即使ZP破裂囊胚也不能正常孵化,囊胚最終坍塌和退化。Niimura[11]通過延時顯微攝影技術分析小鼠囊胚的收縮情況,出現連續的弱收縮(體積縮小<20%)的囊胚大部分能正常孵化,而那些出現強烈皺縮(體積縮小≥20%)的囊胚則不能正常孵化,囊胚是否出現強烈皺縮可以用來評估小鼠胚胎的發育能力。Iwata等[12]觀察人類囊胚體外孵化的過程也報道了類似的結果,未孵化囊胚的自發性皺縮次數明顯高于成功孵化的囊胚,囊胚經歷幾次自發性皺縮后最終退化。

Marcos等[1]將滋養外胚層細胞表面從透明帶的內側分離的面積≥50%定義為皺縮,面積<50%為胚胎搏動,視為收縮,并首次報道了人囊胚自發性皺縮對妊娠結局的影響。通過TLM精確觀察到囊胚自發性皺縮與植入率降低相關(35.1%vs.48.5%,P<0.05),建議優先選擇沒有出現自發性皺縮的囊胚移植,并建議將囊胚是否出現自發性皺縮作為現有胚胎選擇模型的附加標準。Sciorio等[13]通過TLM回顧性分析了356個新鮮周期D5單囊胚移植的妊娠結局,結果發現與294例移植未皺縮囊胚周期相比,移植62例自發性皺縮囊胚(體積減小≥50%)周期植入率(22.6%vs.61.2%,P<0.01)和持續妊娠率(ongoing pregnancy rate,OPR)明顯降低(17.7%vs.53.7%,P<0.01),囊胚出現自發性皺縮可以作為低妊娠結局的胚胎標志物。Sciorio等[14]另一篇研究回顧性分析了1297例新鮮周期D5單囊胚移植的妊娠結局后發現,移植自發性皺縮囊胚周期(259例)持續妊娠率顯著下降(37.5%vs.51.9%,P<0.01),對OPR進行Logistic回歸分析后未皺縮組與皺縮組囊胚植入的OR為1.99(95%CI:1.43～2.75),移植自發性皺縮囊胚后植入并產生妊娠的可能性更小,自發性皺縮可以作為單囊胚移植胚胎選擇的新標志物。

在本研究中,我們回顧性分析了凍融移植周期單囊胚移植后自發性皺縮與妊娠結局的關系,與未皺縮組相比,皺縮組的著床率、臨床妊娠率、活產率均有一定程度降低,早期流產率升高,但僅活產率差異有統計學意義(P<0.01)?？紤]混雜因素后,皺縮組與未皺縮組的活產OR為0.54(P<0.05),囊胚自發性皺縮是影響活產的危險因素,囊胚出現自發性皺縮會影響ART的最終結局,導致活產的機會變小。自發性皺縮對近期妊娠結局指標(著床率、臨床妊娠率、早期流產率)影響不明顯,但對遠期妊娠結局(是否活產)影響顯著,考慮可能與以下幾個方面有關:①滋養外胚層的形態和擴張是預測活產的重要參數[15],囊胚發育時出現自發性皺縮后再膨脹可能會導致胚胎失去水分,損傷細胞之間的連接,導致營養外胚層細胞的功能和結構異常[13-14],最終影響活產。②囊胚自發性皺縮后的再膨脹過程需要大量的能量,胚胎發生自發性皺縮后Na+/K+-ATPase需求量增加[11],能量的過度消耗可能會對胚胎產生有害的長期影響。③自發性皺縮的牛囊胚培養20 h后不能從培養液中吸收葡萄糖,而葡萄糖是體外囊胚發育的必要因素,自發性皺縮對代謝過程產生不利影響,從而對妊娠結局產生負面影響[16-17]。此外,我們還比較了兩組間單胎妊娠的新生兒結局,兩組間新生兒出生時天數、出生體重、男性新生兒比例均無明顯差異(均P>0.05)。兩組活產新生兒中各有2例早產,皺縮組單胎妊娠新生兒有1例出生缺陷,為嬰兒腎上腺增大;未皺縮組單胎妊娠新生兒無出生缺陷。

綜上所述,在凍融移植周期中,囊胚自發性皺縮會降低母體活產率,可以將囊胚是否發生自發性皺縮作為評價囊胚的指標。若患者囊胚數量較多時,盡量不選擇發生自發性皺縮的囊胚移植,這樣有助于進一步改善凍融周期單囊胚移植的妊娠結局;若患者只有自發性皺縮囊胚可以移植,移植后活產并不會增加圍生期不良結局和新生兒缺陷的發生率。在以后的研究中我們期望可以結合TLM準確觀察自發性皺縮次數,準確測量囊胚塌陷的程度,以建立囊胚塌陷模式與妊娠結局之間的關系,將人工智能和機器學習模型作為臨床妊娠的非侵入性標記物,改進胚胎選擇分析的方法,以最終改善患者的妊娠結局。