lncRNA CASC11靶向調控miR-146a-3p對結腸癌細胞增殖、侵襲的影響*

廖薇薇, 傅祥煒, 溫必盛, 楊維忠△

海南醫學院第二附屬醫院 1消化內鏡科 2普通外科,?？?570311

結腸癌是起源于結腸黏膜的消化系統惡性腫瘤,好發于乙狀結腸,在我國發病率較高,患者的5年生存率約65%。結腸癌細胞易發生轉移,其中淋巴轉移常見,血行轉移以經門靜脈至肝最多見,也可直接蔓延侵犯鄰近的組織和器官,造成患者生存率進一步降低。因此抑制結腸癌生長并抑制癌細胞轉移,是提高患者生存率的關鍵[1-2]。癌癥易感候選基因11(cancer susceptibility candidate 11,CASC11)作為一種新近發現的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA),在肝癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌等多種癌癥中發揮著重要的調控作用。以往研究表明,下調CASC11表達可抑制肝癌細胞的糖代謝、增殖和遷移[3-4];CASC11的高表達與宮頸癌患者的遠期生存率呈負相關,對宮頸癌的進展起促進作用,沉默CASC11可以抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲,并減慢其腫瘤生長速度[5]。而microRNA-146a-3p(miR-146a-3p)是能夠抑制腫瘤生長轉移的一種抑癌因子,有研究顯示,過表達miR-146a-3p可抑制膀胱癌細胞的侵襲、轉移和生長,并誘導癌細胞衰老[6]。另有研究顯示,非小細胞肺癌癌變組織中miR-146a的表達顯著降低,部分變異基因型如SNP rs2910164可以促進miR-146a的表達,進而上調miR-146a-3p,降低非小細胞肺癌轉移的風險[7]。持續或頻繁的結腸炎癥是導致結直腸癌的重要因素,通過對壞死性小腸結腸炎及克羅恩病的研究發現,給予miR-146a模擬物能改善結直腸的致瘤性炎癥[8-9]。通過以上我們推測,miR-146a-3p可作為結腸癌潛在的治療靶點。通過對Lncbase V.2數據庫[10]檢索可知,lncRNA CASC11與miR-146a-3p之間存在潛在的結合位點,因此推想lncRNA CASC11可能通過對miR-146a-3p的靶向下調來影響結腸癌細胞的增殖及侵襲。本研究通過對體外培養的SW620細胞進行lncRNA CASC11的表達調節,對此猜想進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用人結腸黏膜上皮細胞、人結腸癌組織源細胞及HCT116、SW620、SW480細胞系,以及細胞培養所用胎牛血清(FBS)、胰酶、雙抗、培養液等購自武漢普諾賽生命科技有限公司;lncRNA CASC11 siRNA、lncRNA CASC11 inhibitor陰性對照、miR-146a-3p inhibitor、lncRNA CASC11空載質粒、lncRNA CASC11過表達質粒、miR-146a-3p 3′-UTR無義序列、野生型miR-146a-3p 3′-UTR報告質粒、突變型miR-146a-3p 3′-UTR報告質粒、相關引物、反轉錄熒光定量試劑盒、Trizol試劑均購自上海生工生物工程股份有限公司;EdU細胞增殖檢測試劑盒、基底膠、LipofectamineTM2000、MTT試劑盒、結晶紫染色液、兔源抗人Bax抗體、小鼠源抗人Bcl-2抗體、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司;SDS-PAGE凝膠、5%抗體封閉液、小鼠抗人Vimentin及E-cadherin抗體、Alexa Fluor488標記的山羊抗小鼠二抗、Alexa Fluor 555標記的驢抗兔二抗、辣根酶標記多克隆二抗均購自上海碧云天生物技術有限公司。

儀器:M200 PRO型全波長自動酶標儀(Tecan公司,瑞士);FSX100型倒置熒光雙目顯微鏡、AE2000型倒置光學顯微鏡(奧林巴斯公司,日本);CFX96型熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司,美國);ABI 7500型實時熒光定量PCR系統(Applied Biosystems公司,美國)等。

1.2 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)

細胞培養:37℃水浴解凍細胞后離心,以含有10% FBS和1%雙抗的完全培養液重懸細胞,然后分別接種在培養瓶中于37.5℃、5% CO2無菌培養箱中培養,細胞長至95%匯合度時進行傳代。

使用Trizol試劑分別提取人結腸黏膜上皮細胞、人結腸癌組織源細胞及人結腸癌細胞株HCT116、SW620、SW480中的總RNA,通過一步法反轉錄熒光定量試劑盒進行定量PCR,選取GAPDH作為lncRNA CASC11的內參,U6作為miR-146a-3p的內參,配制20 μL反應體系,反應程序設定:50℃ 5 min,95℃ 3 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,共40個循環。通過2-ΔΔCt法計算lncRNA CASC11、miR-146a-3p的相對表達量,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 蛋白免疫印跡(Western blot)實驗

將細胞置于冰上研磨,使用RIPA提取細胞總蛋白。蛋白上樣量為20 μg,使用10%的SDS-PAGE凝膠電泳并轉移到PVDF膜上。5%BSA封閉,一抗(1∶1000)4℃搖床孵育過夜。第二天室溫孵育二抗(1∶5000)1 h。ECL顯色液顯影。

1.4 SW620細胞轉染

將傳代后的SW620細胞接種在無菌12孔板中,隨機分為空白對照組(未處理組)、lncRNA CASC11 siRNA組、lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組及lncRNA CASC11 siRNA+miR-146a-3p inhibitor共轉染組(miR-146a-3p抑制組),培養12 h后更換為Opti-MEMⅠ培養液,使用LipofectamineTM2000對細胞進行轉染,lncRNA CASC11 siRNA組與lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組分別轉染lncRNA CASC11 siRNA及其陰性對照,miR-146a-3p抑制組轉染lncRNA CASC11 siRNA與miR-146a-3p inhibitor,6 h后更換為完全培養液,繼續培養24 h后收集細胞備用。

1.5 檢測SW620細胞增殖

MTT法:將SW620細胞接種在無菌96孔板中分組處理,每組設6個重復孔。轉染24 h后更換為50 μL含MTT的培養液,并繼續培養4.5 h后吸出,保留底部結晶,加入150 μL二甲基亞砜充分溶解結晶,于酶標儀490 nm波長下測量各孔吸光度值,計算細胞活力(%)=(轉染組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100%。

EdU法:將分組處理的SW620細胞接種在無菌的12孔板,加入50 μmol/L EdU溶液繼續培養2 h后吸出,PBS洗滌細胞,加入4%多聚甲醛溶液固定后,參照EdU細胞增殖檢測試劑盒說明于熒光顯微鏡下觀察并拍照,所得圖像運用Image J軟件進行計數,得出EdU陽性率=EdU陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.6 檢測SW620細胞侵襲能力

通過Transwell小室檢測細胞侵襲。將1.4中收集的各組SW620細胞調整至相同密度后分組接種在含FBS的完全培養液的上室中培養,在下室中加入不含血清的Leibovitz’s L-15培養液,培養24 h后棄去下室培養液,PBS洗滌后,用4%多聚甲醛溶液固定,結晶紫染色液染色,于光學顯微鏡下觀察、拍照、計數著色細胞。

1.7 檢測SW620細胞凋亡蛋白表達

將傳代后的SW620細胞接種在預先置入爬片的無菌12孔板中,培養、分組及轉染方法同1.4。24 h后取出爬片,經漂洗、固定、通透、封閉后,進行一抗孵育,兔源抗人Bax抗體(1∶200)和小鼠源抗人Bcl-2抗體(1∶100)4℃孵育過夜;第2天PBS漂洗爬片后以Alexa Fluor 488標記的山羊抗小鼠二抗及Alexa Fluor 555標記的驢抗兔二抗室溫避光孵育10 min,染核后封片。每張爬片隨機采集3個視野,Image J軟件對每個視野Bax、Bcl-2蛋白的平均熒光強度進行定量后取均值,并計算Bax/Bcl-2比值(Bax蛋白的平均熒光強度/Bcl-2蛋白的平均熒光強度)。

1.8 檢測SW620細胞lncRNA CASC11、miR-146a-3p及上皮間質轉化標志Vimentin、E-cadherin mRNA及蛋白表達量

提取1.4中各組細胞總RNA,通過qRT-PCR檢測各組細胞中lncRNA CASC11、miR-146a-3p表達量。通過Western blot檢測Vimentin、E-cadherin的蛋白表達量。選擇GAPDH作為Vimentin、E-cadherin的內參基因。各基因引物序列見表1。

1.9 檢測SW620細胞中lncRNA CASC11對miR-146a-3p的靶向調控

將傳代后的SW620細胞接種于無菌12孔板,37.5℃、5%CO2培養12 h后隨機分為miR-146a-3p無義序列+lncRNA CASC11空載組、miR-146a-3p無義序列+lncRNA CASC11過表達組、野生型miR-146a-3p+lncRNA CASC11空載組、野生型miR-146a-3p+lncRNA CASC11過表達組、突變型miR-146a-3p+lncRNA CASC11空載組、突變型miR-146a-3p+lncRNA CASC11過表達組,按照1.4中方法分別對各組細胞進行相應轉染處理,24 h后收集各組細胞,參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測各組細胞雙熒光素酶的相對活性。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 lncRNA CASC11和miR-146a-3p在結腸癌細胞中的表達

與人結腸黏膜上皮細胞相比,人結腸癌組織源細胞和人結腸癌細胞株HCT116、SW480、SW620中lncRNA CASC11表達量明顯升高(均P<0.05),而miR-146a-3p表達量明顯降低(均P<0.05)(圖1)。

1:人結腸黏膜上皮細胞;2:人結腸癌組織源細胞;3:HCT116;4:SW480;5:SW620;A:lncRNA CASC11表達水平;B:miR-146a-3p表達水平;*P<0.05

2.2 lncRNA CASC11調控SW620細胞增殖

與空白對照組相比,lncRNA CASC11 siRNA組細胞活力、EdU陽性率均降低(均P<0.05),lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組細胞活力、Edu陽性率均無顯著變化(均P>0.05);與lncRNA CASC11 siRNA組相比,共轉染組細胞活力、EdU陽性率均升高(均P<0.05)(圖2)。

1:空白對照組;2:lncRNA CASC11 siRNA組;3:lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組;4共轉染組;A:EdU染色代表性圖;B:MTT法檢測細胞活力;C:EdU陽性細胞比例;*P<0.05

2.3 lncRNA CASC11調控SW620細胞侵襲能力

與空白對照組相比,lncRNA CASC11 siRNA組侵襲細胞數明顯減少(P<0.05),lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組侵襲細胞數無顯著差異(P>0.05);與lncRNA CASC11 siRNA組相比,共轉染組侵襲細胞數升高(P<0.05)(圖3)。

1:空白對照組;2:lncRNA CASC11 siRNA組;3:lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組;4共轉染組;A:細胞侵襲實驗結果代表圖;B:侵襲細胞數目;*P<0.05

2.4 lncRNA CASC11調控SW620細胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達

與空白對照組相比,lncRNA CASC11 siRNA組細胞Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05),lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組Bax/Bcl-2比值無顯著差異(P>0.05);與lncRNA CASC11 siRNA組相比,共轉染組細胞Bax/Bcl-2比值有所降低(P<0.05)(圖4)。

1:空白對照組;2:lncRNA CASC11 siRNA組;3:lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組;4共轉染組;A:Bax/Bcl-2免疫熒光染色代表圖;B:Bax/Bcl-2熒光強度比值;*P<0.05

2.5 lncRNA CASC11調控SW620細胞中miR-146a-3p和上皮間質轉化標志基因的表達

與空白對照組相比,lncRNA CASC11 siRNA組細胞Vimentin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05),miR-146a-3p及E-cadherin表達均升高(均P<0.05),而lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組miR-146a-3p與Vimentin、E-cadherin表達無顯著差異(均P>0.05);與lncRNA CASC11 siRNA組相比,共轉染組細胞Vimentin表達升高(P<0.05),miR-146a-3p及E-cadherin表達均降低(P<0.05)見圖5。

1:空白對照組;2:lncRNA CASC11 siRNA組;3:lncRNA CASC11 siRNA陰性對照組;4:共轉染組;A:miR-146a-3p mRNA表達水平;B:E-cadherin蛋白表達水平;C:Vimentin蛋白表達水平;*P<0.05

2.6 lncRNA CASC11靶向調控SW620細胞中miR-146a-3p的表達

通過Lncbase V.2預測到lncRNA CASC11與miR-146a-3p之間可能存在結合位點(圖6A)。與野生型miR-146a-3p+lncRNA CASC11空載組相比,野生型miR-146a-3p+lncRNA CASC11過表達組相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(圖6B);而miR-146a-3p無義序列+lncRNA CASC11空載組、miR-146a-3p無義序列+lncRNA CASC11過表達組、突變型miR-146a-3p+lncRNA CASC11空載組、突變型miR-146a-3p+lncRNA CASC11過表達組之間相對熒光素酶活性無顯著差異(均P>0.05)(圖6B)。

A:miR-146a-3p與CASC11結合位點;B:相對熒光素酶報告基因活性;a:miR-146a-3p無義序列+lncRNA CASC11空載組;b:miR-146a-3p無義序列+lncRNA CASC11過表達組;c:野生型miR-146a-3p+lncRNA CASC11空載組;d:野生型miR-146a-3p+lncRNA CASC11過表達組;e:突變型miR-146a-3p+lncRNA CASC11空載組;f:突變型miR-146a-3p+lncRNA CASC11過表達組;*P<0.05

2.7 lncRNA CASC11調控SW620細胞中miR-146a-3p的下游靶基因c-Met的表達

Bleau等[11]研究發現在結腸癌細胞中,c-Met是miR-146a的靶蛋白。因此,我們采用qRT-PCR和Western blot實驗進一步驗證lncRNA CASC11對miR-146a-3p下游靶基因c-Met的調控作用。實驗結果發現,與對照組相比較,過表達lncRNA CASC11可以顯著上調c-Met的mRNA和蛋白表達,反之,敲低lncRNA CASC11可以顯著下調c-Met的mRNA和蛋白表達(圖7)。

1:siRNA陰性對照組;2:lncRNA CASC11 siRNA組;3:對照組;4 lncRNA CASC11過表達組;A:c-Met的mRNA表達水平;B:c-Met的蛋白表達水平;*P<0.05

3 討論

近年來,我國結腸癌患病人數不斷增加,并且呈現年輕化趨勢。手術、放療及化療是結腸癌診療指南中的常規治療手段,但結腸癌患者死亡率仍居高不下。因此,探究結腸癌的潛在致病機制和癌細胞的生物學行為及其影響因素,對于探索新型結腸癌治療策略的意義重大[12-13]。CASC11作為一種在多種癌癥中均有過報道存在過表達的lncRNA,研究報道其對大多數類型腫瘤的生長及轉移起到促進作用,敲除CASC11可抑制包括前列腺癌在內的多種癌細胞的增殖、侵襲和遷移[14-15]。另有研究證實,CASC11在結直腸癌中異常高表達[16],因此CASC11有可能成為結直腸癌的潛在治療靶點。我們的研究結果顯示,與人正常結腸黏膜上皮細胞相比,人結腸癌組織源細胞和人結腸癌細胞株HCT116、SW480、SW620中lncRNA CASC11表達明顯升高。lncRNA CASC11沉默后的SW620細胞,細胞活力和EdU染色陽性率明顯降低;而對Bax/Bcl-2比值及E-cadherin、Vimentin的表達及細胞侵襲能力的調控作用,表明lncRNA CASC11還能夠介導結腸癌的凋亡及轉移過程。Zhang等[17]研究發現lncRNA CASC11通過與miR-646及miR-381-3p結合并促進結直腸癌的惡性進展,并在機制上明確了RAB11 FIP2是miR-646和miR-381-3p的共同靶蛋白。本研究豐富了lncRNA CASC11在結直腸癌中作用的機制,我們發現lncRNA CASC11可通過抑制miR-381-3p的表達進而抑制凋亡相關蛋白的表達,并最終誘導上皮間質轉化相關基因的表達,促進c-Met的mRNA和蛋白表達,從而影響結直腸癌的增殖與侵襲。

除此之外,我們知道炎癥是結腸癌的重要致病因素[18]。以往有研究報道,miR-146a-3p在結腸炎患兒腸道中的表達明顯下調,證實其低表達可能與結腸炎的發生有關[8];除此之外,下調miR-146a-3p還能夠顯著提高前列腺癌細胞的存活率及癌細胞對雄激素剝奪療法的抵抗性[19];促進miR-146a表達可反應性升高miR-146a-3p的表達水平,可以降低肺癌、鼻咽癌的基因易感性[7,20]。而miR-146a作為一種已知的腫瘤抑制因子,不僅具有抗炎作用,還能夠促進白血病病變細胞凋亡,減緩白血病進展[21],由此推測miR-146a-3p也可以作為結腸癌的潛在治療靶點。我們通過Lncbase V.2數據庫查詢到lncRNA CASC11與miR-146a-3p之間有潛在的結合位點,因而推測通過敲減lncRNA CASC11表達來抑制結腸癌細胞增殖及侵襲的作用可能是通過下調下游miR-146a-3p實現的。本研究通過拯救實驗對此猜想進行驗證,結果證實相比lncRNA CASC11 siRNA組的SW620細胞,miR-146a-3p抑制組(共轉染組)的SW620細胞活力、EdU染色陽性率、侵襲細胞數、細胞Vimentin表達均升高,而Bax/Bcl-2比值、miR-146a-3p及E-cadherin表達均降低,證實miR-146a-3p inhibitor能夠減弱通過敲減CASC11對結腸癌細胞產生的增殖侵襲的抑制作用。且雙熒光素酶報告基因檢測證實SW620細胞中lncRNA CASC11可靶向降低miR-146a-3p的表達,提示CASC11能夠通過靶向下調miR-146a-3p的表達參與結腸癌的生長和轉移過程,而沉默CASC11后miR-146a-3p的表達增加,結腸癌細胞的增殖及侵襲活力降低。

綜上所述,本研究證實了lncRNA CASC11在人結腸癌細胞中高表達,lncRNA CASC11可通過靶向下調miR-146a-3p調控結腸癌細胞的增殖及轉移,敲低CASC11可顯著降低結腸癌細胞的增殖及侵襲,促進其凋亡。本研究為尋求結腸癌新的臨床診療手段提供了思路。