體外培育牛黃配伍冰片激活PI3K/Akt通路抑制腦缺血再灌注模型大鼠神經元凋亡*

陳 海, 任敉宏, 郭曉慶, 李 勇, 李紅燕, 馬 榮, 謝 倩, 王 建△

1成都中醫藥大學藥學院,西南特色中藥資源國家重點實驗室,中藥材標準化教育部重點實驗室,成都 611137 2長治醫學院藥學院,長治 046000 3北京瑞諾眾德科技有限公司,北京 100089

牛黃與冰片均具有“開竅醒神”功效,中醫臨床中常配伍使用治療中風,且療效明確。清代蔣介繁《本草擇要綱目》:“凡中風入臟者,必用牛雄腦麝之劑,入骨髓、透肌膚、以引風出”,其中牛為牛黃,腦為龍腦(即冰片)。

查閱文獻發現目前牛黃配伍冰片改善腦缺血再灌注(CIRI)的基礎研究鮮見,課題組前期研究證明了牛黃與冰片配伍對腦缺血再灌注模型大鼠的腦保護作用,并基于血管新生探討了其可能的機制,結果發現藥物干預后缺血側皮層區神經元及新生血管密度顯著高于溶劑模型組[1]。由于CIRI會導致神經組織損傷,主要表現為神經元的凋亡[2-3],而中藥具有多成分、多靶點的特點,故作出“牛黃配伍冰片能抑制CIRI后神經元凋亡”的推斷。磷酯酰激醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路是細胞重要的存活通路之一,與細胞凋亡關系密切[4-5]。故本文以PI3K/Akt信號通路為切入點,探討牛黃配伍冰片的腦保護作用是否與抑制腦缺血再灌注后神經元凋亡有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠,體重250～270 g,8～10周齡,由北京斯貝福生物技術有限公司提供,動物許可證號:SCXK(京)2019-0010,動物質量合格證號:No.110324200103134075。實驗動物飼養于成都中醫藥大學實驗動物中心(室內溫度控制在23～27 ℃,相對濕度50%左右,且通風良好,飼料、飲水自由)。本研究涉及的動物實驗經成都中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準,批準號TCM-2016-312。

1.2 藥物與試劑

本研究中牛黃使用體外培育牛黃,購于武漢天鵬醫藥有限公司;三種商品冰片中選擇使用艾片,購于貴州羅甸艾納香藥業有限公司。尼莫地平片(亞寶藥業集團股份有限公司,批號190312);注射用青霉素鈉(哈藥集團制藥總廠,批號17121209-2);水合氯醛、吐溫80(成都市科隆化學品有限公司,批號:2018103001、2019070301);兔抗p-PI3K、PI3K抗體(Abcam,批號:ab182651、ab191606);兔抗p-Akt、Akt抗體(Cell signaling technology,批號:S473、C67E7);兔抗Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體(GeneTex,批號:GTX110543、GTX109683、GTX100064);兔抗GAPDH抗體(Affinity,AF7021);Trizol Reagent(北京雷根生物技術有限公司,批號:NR002)。Tunel Cell Apoptosis Detection Kit(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號:G1507)。

1.3 藥物劑量

參照課題組前期研究的計算方法[6],體外培育牛黃的高、中、低劑量分別為0.20、0.10、0.05 g/kg。陽性對照藥物選用尼莫地平,劑量為0.012 g/kg。

1.4 主要儀器

全自動輪轉式石蠟切片機(LEICA,RM2255);奧林巴斯光學顯微鏡(OLYMPUS BX43,濟南千司生物科技有限公司);高速組織研磨儀(賽維爾,型號KZ-Ⅱ);電泳儀、熒光定量PCR儀(BIO-RAD,型號:1658033、CFX connect);免染型化學發光凝膠成像系統(BIO-RAD,ChemiDoc);微量分光光度計(NanoPhotometer N50 Touch)。

1.5 動物分組及造模方法

1.5.1 動物分組 SPF級雄性SD大鼠52只,適應性喂養3 d,隨機分為假手術組,模型組,溶劑模型組,尼莫地平(0.012 g/kg)組,體外培育牛黃0.20、0.10、0.05 g/kg組,艾片0.20、0.10、0.05 g/kg組,配伍0.40、0.20、0.10 g/kg組,共13組,每組4只。每天定時稱重并按10 mL/kg體積灌胃,假手術組和模型組給予生理鹽水,溶劑模型組給予2%吐溫-80溶液。預防性給藥第3天灌胃30 min后,改良線栓法制備大腦中動脈阻塞(MCAO)模型,缺血90 min后再灌注,造模成功后,繼續灌胃給藥3 d,末次灌胃給藥30 min后,脫頸處死大鼠取材。

1.5.2 模型制備 10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠,翻正反射消失后,將其仰臥于手術臺,四肢固定。采用改良線栓法制備MCAO模型:頸部正中切口,將線栓沿左側頸總動脈向頸內動脈插入20 mm,穿過大腦中動脈(MCA)起始端至大腦前動脈(ACA)近端,缺血90 min后抽出線栓,縫合傷口。大鼠蘇醒后Longa評分≥1分為造模成功。假手術組僅進行皮膚切開和血管分離操作,不做線栓處理,剩余操作同其他組。

1.6 蘇木精-伊紅(HE)染色

取模型大鼠缺血側皮層及海馬區腦組織,10%甲醛固定,石蠟包埋,HE染色。光鏡下(×40,×200)觀察各組大腦皮層的損傷情況,并按以下方法進行半定量比較:無病變,計0分,病變面積小于10%計1分,面積為10%～計2分,30%～計3分,大于50%計4分。使用Image J軟件對200倍鏡下海馬CA1區正常神經元進行計數。

1.7 Tunel染色觀察皮層神經元凋亡

石蠟切片,按Tunel染色試劑盒步驟操作,拍照后400倍光鏡下使用Image ProPlus 6.0軟件對染色陽性細胞進行計數。凋亡指數=視野內凋亡的神經元數/視野內所有神經元數×100%。

1.8 qRT-PCR檢測相關蛋白mRNA表達

取缺血側皮層腦組織50 mg,Trizol法提取總RNA,反轉錄合成cDNA。美國生物技術信息中心(NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載大鼠PI3K、Akt、Capase-3、Bax、Bcl-2基因全序列,使用引物軟件(Primer Premier)設計和篩選引物,引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成,各引物序列如表1所示。熒光定量PCR反應條件:95 ℃,2 min預變性;95 ℃變性10 s,55 ℃退火延伸30 s,進行40個循環。用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

表1 引物序列信息

1.9 Western blot法檢測PI3K/Akt通路相關蛋白的表達

取缺血側皮層腦組織50 mg提取總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。用PBS及5×Loading buffer稀釋蛋白樣品,SDS-PAGE電泳后,轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。使用5%脫脂奶粉封閉2 h,4 ℃下一抗孵育過夜。TBST洗滌后,孵育二抗,最后使用增強化學發光試劑在ChemiDoc成像系統顯影成像。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 對皮層及海馬區腦組織病理的影響

光鏡40倍和200倍視野下,觀察對腦缺血再灌注模型大鼠海馬、皮層區的影響,并對皮層區的損傷及海馬CA1區正常神經元計數進行半定量分析。由圖1可見,與假手術組比較,模型組、溶劑模型組的腦皮層損傷評分顯著增加,神經元計數顯著減少(均P<0.01)。與溶劑模型組相比,牛黃3個劑量組,艾片0.20 g/kg組,配伍3個劑量組的皮層損傷得分均顯著降低,海馬CA1區神經元計數顯著增加(P<0.01或P<0.05)。配伍0.10 g/kg組海馬CA1區神經元計數有高于牛黃0.05 g/kg組的趨勢。

與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與溶劑模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;n=4

綜合前期研究藥效學及血管新生相關指標結果[1],選取牛黃0.20 g/kg組(以下簡稱牛黃組)、艾片0.20 g/kg組(以下簡稱艾片組)及配伍0.40 g/kg組(以下簡稱配伍組)進行機制探討。

2.2 對皮層神經元凋亡的影響

將MCAO模型大鼠缺血側大腦皮層組織進行Tunel染色,光鏡(×100,×400)觀察其染色結果,如圖2所示。與假手術組相比,溶劑模型組大鼠皮層神經元凋亡指數顯著升高(P<0.01)。與溶劑模型組比較,牛黃組、配伍組皮層神經元凋亡指數顯著降低(均P<0.01)。

1:假手術組;2:溶劑模型組;3:艾片組;4:牛黃組;5:配伍組;紅色箭頭所指的為凋亡細胞;與溶劑模型組比較,##P<0.01;n=3

2.3 對PI3K/Akt通路相關蛋白mRNA表達的影響

采用qRT-PCR技術檢測缺血側腦組織中PI3K/Akt通路相關蛋白mRNA的表達。

與假手術組比較,溶劑模型組缺血側腦組織中PI3K、Akt、Bcl-2 mRNA表達顯著降低,Caspase-3、Bax mRNA表達以及Bax/Bcl-2比值顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與溶劑模型組比較,牛黃、艾片及其配伍組均能顯著降低Caspase-3、Bax mRNA表達;配伍組Akt、Bcl-2 mRNA表達顯著升高,Bax/Bcl-2比值顯著降低,且配伍組這一效果顯著優于牛黃組(P<0.01)。見圖3。

1:假手術組;2:溶劑模型組;3:艾片組;4:牛黃組;5:配伍組;與溶劑模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與牛黃組比較,&&P<0.01

2.4 對PI3K/Akt通路蛋白表達的影響

Western blot檢測PI3K/Akt通路p-PI3K、p-Akt、Caspase-3、Bax、Bcl-2的蛋白表達,并計算Bax/Bcl-2比值,結果如圖4所示。與假手術組比較,溶劑模型組缺血側腦組織中p-PI3K、p-Akt及Bcl-2蛋白表達顯著降低,Caspase-3、Bax蛋白表達以及Bax/Bcl-2比值顯著升高(均P<0.01)。與溶劑模型組比較,牛黃、艾片及配伍組均能顯著升高p-PI3K及p-Akt蛋白表達,顯著降低Caspase-3、Bax蛋白表達,降低Bax/Bcl-2比值,配伍組能顯著升高Bcl-2蛋白表達;在升高p-Akt及Bcl-2蛋白與降低Caspase-3蛋白表達方面,配伍組明顯優于牛黃組(P<0.05或P<0.01)。

1:假手術組;2:溶劑模型組;3:艾片組;4:牛黃組;5:配伍組;A:相關蛋白電泳圖;B～F:p-PI3K、p-Akt、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平半定量;G:Bax/Bcl-2比值;與溶劑模型組比較,#P<0.05,##P<0.01;與牛黃組比較,&P<0.05,&&P<0.01

3 討論

PI3K/Akt信號通路與細胞凋亡關系密切,PI3K活化后,可磷酸化下游的Akt,Akt活化后可促進細胞生存及抑制凋亡:Akt可通過磷酸化mTOR的負調控因子,從而促進mTOR的活化,促進細胞生存;Akt可磷酸化Caspase-9后減弱Caspase-9的活性,抑制由于Caspase-9活化而引起的級聯反應;Akt可直接磷酸化Bcl-2家族蛋白BAD,使BAD不能與Bcl-2和Bcl-X結合,從而抑制BAD誘導的細胞凋亡;Akt還能磷酸化糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)以抑制其活性,對細胞內的能量進行代謝調節,從而抑制凋亡[4-5];此外,Akt還可磷酸化多種轉錄因子,以抑制細胞凋亡,促進細胞的生存:①直接磷酸化Forkhead家族轉錄因子。Forkhead家族轉錄因子與細胞生存關系密切,磷酸化的Forkhead可以通過其靶基因而促進細胞生存[6];②與MDM2結合并磷酸化MDM2,使p53降解或失活,抑制p53誘導的細胞凋亡[7];③直接或間接調節NF-κB激酶活性,使NF-κB轉移至細胞核并提高其活性,促進NF-κB依賴的生存相關基因的轉錄和表達,從而促進細胞生存[7];④磷酸化環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)和YES相關蛋白(YAP),增加它們的轉錄活性以抑制凋亡。PI3K/Akt信號通路與凋亡的關系如圖5所示。

圖5 PI3K/Akt信號通路與凋亡的關系

PI3K/Akt信號通路激活后,還可作用于NF-κB、mTOR、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)、一氧化氮合成酶(NOS)等下游靶點以發揮抗凋亡作用。①作用于下游靶點NF-κB:研究發現CXCL8基因沉默可通過調節PI3K/Akt下游的NF-κB,抑制神經膠質細胞損失和凋亡指數[8];大黃素可抑制人第10號染色體上PTEN基因的表達,激活PI3K/Akt通路,降低NF-κB p50核蛋白轉錄水平,從而抑制神經細胞凋亡[9];益髓解毒法可激活PI3K/Akt信號通路,通過使大鼠海馬組織內NF-κB蛋白和基因表達上調、使Caspase-3、Caspase-9以及BAD蛋白和基因表達下調,從而發揮抗凋亡作用[10]。②作用于下游靶點mTOR:曲美汀酸B在體內和體外的腦缺血模型中均可通過抑制微小RNA-10a(miRNA-10a)表達,激活PI3K/Akt/mTOR信號通路,從而減少線粒體介導的細胞凋亡[11]。③作用于下游靶點GSK-3β:激活PI3K-Akt-GSK-3β通路,可降低促凋亡蛋白Bax的表達,升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,以發揮抗凋亡作用[12-13]。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)處理可激活PI3K/Akt信號通路,通過調控GSK-3β進而影響Wnt/β-catenin信號通路,從而發揮抗凋亡作用[14]。④作用于下游靶點NOS:鞣花酸可激活PI3K/Akt信號通路,作用于下游的NOS,降低大鼠缺血側腦組織促凋亡相關蛋白(Bax、CytoC、Caspase-3)的水平而具有抗凋亡作用[15]。

另外,激活PI3K/Akt通路,還可以減輕ERS及抑制線粒體介導的凋亡通路以發揮抗凋亡作用。激活PI3K/Akt通路,可顯著逆轉神經元損傷和ERS的細胞凋亡[16-17];激活PI3K/Akt通路,可上調腦組織中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和升高Bcl-2/Bax比值,下調促凋亡蛋白Bax、CytoC、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達以發揮抗凋亡作用[18]。

本實驗研究結果顯示,體外培育牛黃、艾片及兩藥配伍后顯著減輕缺血側腦組織病理損傷、減輕缺血側皮層神經元凋亡;可顯著上調p-PI3K及p-Akt蛋白,下調Bax、Caspase-3蛋白,降低Bax/Bcl-2比值,表明PI3K/Akt信號通路被激活,體外培育牛黃、艾片及兩藥配伍調控MCAO模型大鼠的機制可能與激活PI3K/Akt通路、抑制凋亡有關。體外培育牛黃及配伍組均可上調p-Akt、Bcl-2表達,下調Caspase-3表達、降低Bax/Bcl-2比值,且配伍組顯著優于牛黃組,一定程度上體現了“相使”增效的配伍關系。

本研究首次以體外培育牛黃配伍冰片為研究對象,以腦缺血再灌注模型大鼠為載體,闡釋了體外培育牛黃、冰片及二者配伍通過激活PI3K/Akt通路抗神經元凋亡而發揮腦保護作用,可能是其表現出“開竅醒神”功效的分子生物學基礎。然而中藥具有多成分多靶點的特點,其是否還與抗炎以及神經發生有關,對腦缺血后期是否具有保護作用等,均有待今后更深入研究。