超重度免疫缺陷SPF 小鼠感染大腸埃希菌的案例分析

聶永勝，高求煒，周 爍，王 瑋

（ 仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510000 ）

大腸桿菌病是由大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）引起的細菌性人畜共患病[1]。大腸埃希菌是動物或人腸道內的正常菌群，一般情況不具有致病力，只有某些特殊血清型的大腸埃希菌具有致病性[2]，屬于革蘭氏陰性短桿菌，大小為（1.1～1.5） μm×（2～6） μm，多數有周身鞭毛[3]。在開展動物試驗時，實驗動物的異常死亡應引起重視，調查清楚死亡原因并明確其對試驗結果的影響是實驗動物獸醫的職責。

在某次開展藥效學試驗時，實驗室購買超重度免疫缺陷SPF 小鼠300 只（5～6 周齡，雌性，體重20～25 g），到貨時發現死亡3 只，后續檢疫期內陸續發現死亡5 只，共死亡8 只。為探究小鼠死亡原因，選擇死亡小鼠中尚未發生自溶的5只小鼠進行大體病理解剖。本研究利用獸醫臨床微生物知識對超重度免疫缺陷小鼠出現死亡的原因進行了充分分析，最終找到了病因，為后續試驗的順利進行提供了幫助。此外，在研究過程中以質譜儀鑒定菌種，本研究結果也可為微生物快速鑒定技術的應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器與耗材

CX23生物顯微鏡（奧林巴斯公司）、SPX150BE生化培養箱（力辰科技有限公司）、BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）、Microflex LT/SH MALDITOF飛行時間質譜儀（德國布魯克公司）等。

營養瓊脂（N/A）平皿（南通凱恒生物科技發展有限公司）、麥康凱培養基（南京全隆生物技術有限公司）、革蘭氏染液（比克曼生物公司）、一次性無菌接種環（比克曼生物公司）、生理鹽水（山東齊都藥業有限公司）；細菌培養試管、細菌生化檢測試劑（廣東環凱生物公司）。解剖鑷子剪刀由上海醫療器械基團有限公司生產，高壓滅菌后使用。

1.1.2 試驗菌株與動物

醫學院?？蒲杏么竽c埃希菌標準菌株（需保密），同品系免疫缺陷SPF小鼠10只（供應商需保密）。

1.2 試驗方法

1.2.1 解剖記錄病理變化

對死亡但尚未發生自溶，具有病理解剖意義的5 只小鼠在二級生物安全柜中進行解剖，全程注意無菌操作并做好自身生物安全防護，拍照觀察記錄相關病理變化。

1.2.2 病變滲出物涂片革蘭氏染色鏡檢

對小鼠胸腹腔滲出物與膠凍樣物質進行涂片，操作方式同血涂片，蘸取一滴滲出液，推片接近滲出液，使液體呈一字展開，推片與載玻片呈30°角，勻速推向另一側，厚薄適中，自然晾干。之后進行革蘭氏染色：結晶紫染60 s，碘液染60 s水洗，無水乙醇脫色30 s，沙黃復染60 s后鏡檢。

1.2.3 病料培養

對滲出物用無菌采樣環劃線接種于無菌普通瓊脂培養基與麥康凱培養基（全程在二級生物安全柜中進行），在生化培養箱中37.0 ℃培養48 h，觀察菌落生長情況，并挑取菌落用無菌液稀釋后涂片，進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4 細菌生化鑒定

培養出的細菌進行純化分批接種于多管細菌培養試管中培養，菌種生長良好，之后開展乳糖、動力、葡萄糖產氣、醋酸鹽等細菌生化鑒定并匯總記錄結果。

1.2.5 質譜儀細菌鑒定

對普通瓊脂與麥康凱培養基培養出的細菌各接種于專業的運輸培養基，送檢第三方機構（檢測機構需保密，有CNAS與CM資質），使用質譜儀對菌種進行鑒定。

1.2.6 攻毒試驗

知悉病原菌種屬后，使用該菌標準菌株對同品系的小鼠10只進行攻毒試驗。設立試驗組與對照組，每組5只小鼠，原菌液進行100 倍稀釋，試驗組每只小鼠灌服0.2 mL菌液，對照組灌服0.2 mL 生理鹽水，飼養于屏障級獨立通風系統籠具（IVC）內，飼養觀察1周。

2 結果與分析

2.1 小鼠剖檢結果（見圖1～圖3）

圖1 小鼠肝臟表面有纖維素性滲出Fig.1 Anatomy shows a fibrinous exudation on the surface of the mice liver

圖2 到貨時死亡小鼠胸腔解剖結果Fig.2 Results of thoracic anatomy of the dead mice upon arrival

圖3 檢疫期內死亡小鼠胸腔解剖結果Fig.3 Results of thoracic anatomy of the dead mice during quarantine period

由圖1～圖3 可知，解剖的5 只小鼠表現的大體病理變化均為胸腹腔纖維素性滲出，部分肝臟表面被纖維素性滲出物附著，還有部分小鼠心肺被大量膠凍樣物質包裹，出現“包心包肝”現象。

2.2 病變滲出物涂片革蘭氏染色鏡檢結果（見圖4）

由圖4 可知，滲出物直接鏡檢可見少量炎性細胞和大量革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 病料培養及培養菌落鏡檢結果（見圖5～圖7）

圖5 普通瓊脂培養皿培養菌落Fig.5 Colonies were cultured in the ordinary AGAR dishes

由圖5、圖6 可知，普通瓊脂菌落呈圓形、直徑為2～3 mm、稍凸、邊緣整齊、灰白色、不透明的菌落、少數菌株出現β溶血環、極少數出現較大、扁平、皺起的粗糙型菌落；在麥康凱瓊脂平板上形成不透明、粉紅色菌落，部分形成中間黃色、周圍紅色菌落。

圖6 麥康凱瓊脂培養皿培養菌落Fig.6 Colonies on the MacConkey AGAR plates

由圖7 可知，滲出物培養皿挑取菌落進行革蘭氏染色鏡檢，培養菌株為革蘭氏陰性短桿菌。

圖7 滲出物培養皿挑取菌落革蘭氏染色鏡檢結果Fig.7 Results of Gram staining microscopy of the colonies picked from the exudate petri dishes

2.4 細菌生化分析結果（見表1）

表1 細菌生化分析結果Tab.1 Results of the bacterial biochemical analysis

由表1可知，分離株乳糖、動力、葡萄糖產氣、醋酸鹽結果均為陽性，生化結果指向大腸埃希菌。

2.5 質譜儀細菌鑒定結果

第三方檢測公司反饋分離株為大腸埃希菌。

2.6 攻毒試驗結果

飼養1周后，對照組小鼠未見異常，試驗組5只同品系小鼠中有2只出現癥狀后死亡，剖檢可見胸腹腔纖維性滲出，胸腔心肺被膠凍樣物質包裹的大體病理變化（見圖8）；對滲出物接種于麥康凱培養基培養，形成粉紅色菌落（見圖9）；對所培養細菌進行革蘭氏染色物鏡檢與質譜儀鑒定，確定分離株為大腸埃希菌（見圖10）。

圖8 攻毒試驗小鼠大體病理表現Fig.8 Gross pathological findings of the mice in challenge experiments

圖10 滲出物革蘭氏鏡檢結果Fig.10 Gram microscopic examination of the exudate

3 討論

大腸埃希菌為動物體內正常菌，作為一種構造簡單的原核生物，因其具有遺傳背景清晰、易培養、生長繁殖快速、在腸道中易成為優勢菌等優點成為如今腸桿菌科原核工程菌的代表性菌株[4]?！吨袊幍洹?010年版收載了大腸埃希菌的確認方法，即4-甲基傘形酮葡糖酸酐（MUG）和靛青質（indole）試驗可作為確認的參考方法；IMViC 試驗【包括靛基質試驗（I）、甲基紅試驗（M）、乙酰甲基甲醇生成試驗（V-P）、枸櫞酸鹽利用試驗（C）試驗】亦可作為鑒定和確認的參考[5]。

在本試驗鑒定過程中，質譜儀發揮了很重要的作用，基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜技術（MALDITOF MS）是一項微生物快速鑒定技術，以其快速、準確、重復性好、高通量的特點在細菌鑒定、耐藥性和毒力監測中發揮重要的作用[6-7]。作為近年來發展起來的新型診斷技術[8-9]，MALDI-TOF MS技術根據細菌的形態、生化、抗原、遺傳等特征，可以快速完成對微生物種、屬水平的鑒定[10]。MALDI-TOF MS 的樣品處理簡單快速，可提供復雜樣品中各組分分子量的信息，逐漸發展成為系統細菌學研究人員的新工具[11]。MALDI-TOF MS 通過將掃描出的質譜數據結果與標準蛋白指紋圖譜庫中的信息進行比對，從而得出鑒定結果[12-13]。

實驗動物按微生物等級劃分為：普通級動物、無特定病原體級動物、無菌級動物[14]。不同級別的實驗動物生活在不同要求的環境中，普通級動物飼養于普通環境，無菌級動物生活在隔離環境中。無特定病原體級動物生活在屏障環境中，該環境要求符合動物居住要求，嚴格控制人員、物品和空氣的進出，適用于飼育清潔級和無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級實驗動物[15]。

超重度免疫缺陷鼠因其自身的免疫系統功能弱，B淋巴細胞、T細胞淋巴極少，樹突狀細胞、自然殺傷細胞等較免疫正常小鼠含量少，易發生微生物感染。因此，超重度免疫缺陷鼠需按照國標要求飼養在符合潔凈度達到5級的環境中，建議使用IVC 或隔離包進行飼養，盡量減少人為污染。大腸埃希菌未列入新國標SPF 級別小鼠必須排除病原，但其對重度免疫缺陷鼠該菌的致病性還需要重點關注。本研究中，對于該菌的感染路徑以及作用機制受限于實驗條件，未能進一步展開；鑒于本試驗中的小鼠生活在屏障環境中，接觸的墊料、飲水、飼料皆是滅菌后使用，且并未發生大規模發病，表明大腸埃希菌在此類小鼠中的傳染性有限。結合攻毒試驗結果，目前推測是部分免疫缺陷小鼠腸道內菌群上行引起的內源性感染[16]。

腸道菌群主要通過跨腸上皮細胞轉運和緊密連接轉運等兩種方式由腸靜脈到達門靜脈或由腸淋巴系統進入體循環?？缂毎D運主要是通過一些特殊的細胞通道以及泵膜，大腸埃希菌、變形桿菌等活細菌主要通過此類方式入侵。緊密連接轉運主要源于腸腔內滲透壓改變、腸上皮細胞骨架及其蛋白構架微管和微絲的直接破壞，大分子如內毒素就是通過疏松的緊密連接進行易位。高度免疫缺陷實驗小鼠T 細胞缺失，致使其盲腸中厭氧菌含量較低，導致厭氧菌對腸桿菌的抑制作用減弱，大腸埃希菌過量繁殖[17]，成為致病菌。有很多文獻描述了腸道微生物易位感染。腸道不僅是最重要的消化和吸收器官，也是機體最大的免疫器官和重要的生理屏障。腸道覆蓋著體內最大的黏膜層，可隔離機體與腸腔內大量內容物，以免微生物的侵襲和毒素、抗原分子的損害。腸腔內含有300～500種細菌，主要集中于下消化道，每毫升糞便中細菌量可達1012，約占糞便干重的60%[18]。在失血、失液、休克、嚴重燒傷、呼吸衰竭、營養不良、嚴重感染、缺血缺氧、嚴重創傷、免疫缺陷等應激狀態下，腸壁通透性增加，腸屏障功能受損，原存在于腸腔內的細菌和毒素向區域淋巴結、門靜脈及外周血易位，黏膜下層免疫細胞異常激活，炎癥介質釋放，進而引發系統性炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）甚至多器官功能障礙 綜 合 征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[19]。為保證科學試驗不受干擾，不能使用抗生素防控實驗動物疾病，可從增強腸道抵抗力與整體免疫力的方面考量，如添加無菌營養膠，保證小鼠飼養環境潔凈度，減少微生物富集，避免價格昂貴的實驗鼠發病死亡。實驗動物獸醫需要作出專業的診斷，查明實驗動物異常的原因，為相關動物試驗的順利開展提供技術支持。

4 結論

本研究中，綜合評估培養基菌落形態、顏色及生化鑒定、質譜儀鑒定、攻毒試驗等結果，判定該批超重度免疫缺陷小鼠發病原因為大腸埃希菌感染，并且由大腸埃希菌易位或上行引起滲出性炎癥最終死亡等可能性較大。