核受體Nur77在結腸癌細胞奧利沙鉑耐藥中的作用及其機制研究

王迎梅, 王瑩, 李超

結腸癌為最常見的消化系統惡性腫瘤之一,其發病率和腫瘤致死率分別位于惡性腫瘤發病率及致死率的第2位和第4位[1]。結腸癌多起病隱匿,約1/3的患者在發現時就已存在轉移,而未發生轉移的局限性結腸癌患者中約50%最終也會出現轉移[2-3]。奧利沙鉑作為結腸癌的重要化療藥物,極大改善了晚期結腸癌的治療現狀,提高了患者的生存質量,但耐藥可影響其治療效果,降低患者預后情況[4-5]。探索腫瘤靶向藥物耐藥性的生物學機制及其應對方案至關重要。近年來有研究學者指出,核受體Nur77可參與細胞的增殖、分化以及惡性腫瘤的發生及發展,且可能與結腸癌患者耐藥密切相關[6-7]。鑒于此,筆者于本研究中探索了核受體Nur77在奧利沙鉑細胞奧利沙鉑耐藥中的作用及其相關機制,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 主要材料與設備 結腸癌細胞SW480:美國Eppendorf公司;奧利沙鉑(DMSO溶解后使用):江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液、RIPA蛋白裂解液:美國Gbico公司;DMEM培養基、慢病毒載體、脂質體-2000:美國Invitrogen公司;PCR擴增系統:TaKaRa公司;引物設計及合成:上海信帆生物科技有限公司;兔NF-κB-p65多抗、兔NF-κB激酶復合體(IκB kinase complex,IKK)多抗、兔磷酸化IKK蛋白(p-IKK)多抗:英國Abcam公司;CO2恒溫細胞培養箱:美國Healforce公司;4 ℃低溫高速離心機:德國Beckman公司;酶標儀:美國Molecular Devices公司;聚丙烯酰胺電泳儀、轉膜儀:美國BioRad公司。

1.2 細胞復蘇、培養 從液氮罐中取出細胞,并迅速轉移至37 ℃水浴箱中孵育至細胞凍存液完全融化后,800 rpm離心10 min離心10 min,棄掉上清液;在超凈臺上吸取細胞沉淀置于37 ℃含有10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養基內重懸,并用移液器將其吹打均勻后接種于含DMEM培養基的培養皿中,37 ℃、5% CO2培養箱中培養,隔天更換1次培養基;待細胞融合度達80%左右時,棄掉培養基,37 ℃的PBS清洗2次,加入37 ℃含EDTA的胰蛋白酶作用至光學顯微鏡下顯示細胞折光性增強并出現明顯細胞間隙后,加入10%胎牛血清終止消化、重懸混勻;按1∶3比例加入含10%胎牛血清DMEM培養基,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,隔天更換1次培養基。

1.3 Nur77載體構建及轉染 嚴格按照PCR試劑盒說明書擴增Nur77及其Nur77抑制物引物,引物序列為Nur77上游5′-AATGAATTCGAATGCCCTGTATCCAAGCCCAA-3′,下游5′-AATGGATCCTCAGA-

AGGGCAGCGTGTCCATG-3′;Nur77抑制物上游5′-GACTTCATAAGAAGAGAGCATGCGCCTTGCGCATGC-3′,下游5′-AAGACTTCATAGAAGCAGGCGCATGCTCT-

TTATGAA-3′。擴增后予以KpnI以及BamHI雙酶切純化,并進行產物序列驗證。在細胞融合度達80%的結腸癌細胞SW480培養皿中分別加入空載pcDNA3.1、Nur77載體及其Nur77抑制物載體與脂質體-2000的混合物(混合比例為1∶1,質粒DNA質量以0.8 μg為準,siRNA以2 nmol為準)進行轉染;熒光檢測轉染成功后,將其置于正常培養基中繼續培養,隔天更換1次培養基。

1.4 MTT法檢測不同濃度奧利沙鉑作用下細胞增殖情況 將正常結腸癌細胞SW480分為空白組與對照組、空載轉染結腸癌細胞SW480設為空載組、Nur77載體轉染結腸癌細胞SW480設為Nur77過表達組、Nur77抑制物載體轉染結腸癌細胞SW480設為Nur77抑制組,取對數生長期各組結腸癌細胞SW480分別接種于96孔板中(每組設定5個復孔)培養24 h;分別加入含0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL奧利沙鉑37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h后,加入20 μL MTT孵育4 h(空白組不加入奧利沙鉑僅做增殖成活率對照使用)。酶標儀測定450 nm處吸光度(OD)值,計算細胞相對增殖成活率及半數抑制濃度(IC50),增殖成活率(%)=(藥物作用組OD值/空白組OD值)×100%。實驗重復5次,取平均值。

1.5 Western blot法檢測各組細胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表達水平 取各組對數生長期細胞,不同濃度奧利沙鉑作用48 h后(方法同1.4),加入RIPA細胞裂解液冰浴15 min后,12 000 rpm離心15 min,提取細胞總蛋白;取蛋白上樣行10%SDS-PAGE凝膠電泳分離、PVDF膜轉膜、5%脫脂奶粉封閉2 h后,1∶500比例分別加入NF-κB-p65、IKK、p-IKK一抗4 ℃孵育過夜;PBS洗滌3次,加入二抗室溫溫育2 h;PBS洗滌3次,ECL化學發光顯影,Image J圖像分析軟件檢測蛋白條帶灰度值。實驗重復5次,取平均值。

1.6 qRT-PCR法檢測各組細胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表達水平 取各組對數生長期細胞,不同濃度奧利沙鉑作用48 h后(方法同1.4),Trizol法提取總RNA;取少量mRNA,檢測其在260 nm及280 nm波長的光密度(optical density,OD)值,若A260/A280值在1.8～2.0之間視為mRNA提取合格;按照qRT-PCR試劑盒說明書反轉錄合成互補DNA,內參采用GAPDH,結果使用公式F=2-△△Ct轉換,NF-κB-p65引物序列為上游5′-TGCTGTGCGGCTCTGCTTCC-3′,下游5′-AGGCTGGGGTCTGCGTAGGG-3′;IKK引物序列為上游5′-CAAAGAACAGAGACCGCTGGTG-3′,下游5′-GCAGTGGCAAA-TCATTGGGTG-3′;p-IKK引物序列為上游5′-AGCTCTGGAACCTCCTGAAGA-3′,下游5′-AGCTCCAGTCTAGGGTCGTGA-3′;GAPDH引物序列上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 Nur77對結腸癌細胞增殖活性及奧利沙鉑敏感性的影響 隨著奧利沙鉑濃度的增加,結腸癌細胞SW480存活率逐漸降低,且尤以Nur77抑制組存活率最低(P<0.05),Nur77過表達組生存率最高P<0.05),詳見表1。

表1 對照組、空載組、Nur77過表達組及Nur77抑制組細胞增殖活性及IC50值對比

2.2 Nur77對結腸癌細胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表達水平的影響 轉染Nur77后的結腸癌細胞內NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表達水平較其他各組細胞升高,差異有統計學意義(P<0.05),而轉染Nur77抑制物的結腸癌細胞內NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表達水平較其他各組細胞降低,差異有統計學意義(P<0.05),詳見表2、圖1。

圖1 各組細胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表達水平條帶圖

表2 對照組、空載組、Nur77過表達組及Nur77抑制組細胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表達水平對比

2.3 Nur77對結腸癌細胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表達水平的影響 轉染Nur77后的結腸癌細胞內NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表達水平較其他各組細胞升高,差異有統計學意義(P<0.05),而轉染Nur77抑制物的結腸癌細胞內NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表達水平較其他各組細胞降低(P<0.05),詳見表3。

表3 對照組、空載組、Nur77過表達組及Nur77抑制組細胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表達水平對比

3 討論

結腸癌發病率和死亡率正在以每年2.4%和1.3%的速度上升[8]。結腸癌發病早期并沒有臨床表現,發現時已出現遠處轉移[9]。流行病學研究顯示,已發生遠處轉移的結腸癌患者對化療的敏感性較差,5年生存率不足30%[10]。奧利沙鉑作為第三代鉑類化療藥物,以DNA為靶點,通過抑制鉑原子與DNA形成交叉聯結拮抗DNA的復制與轉錄,發揮其抗腫瘤生長的作用,在結腸癌的治療中取得了較為顯著的臨床療效[11-12]。然而臨床研究證實,部分患者對此類藥物耐藥,耐藥細胞易逃脫免疫系統的識別與攻擊,患者的預后效果較差[13]。探索奧利沙鉑等藥物耐藥性的生物學機制及其應對方案至關重要。

近年來部分研究證實,Nur77作為孤兒核受體家族成員之一,可通過調控細胞的增殖及凋亡過程而參與腫瘤細胞的發生及發展[14]。NF-κB作為可調控促凋亡和抗凋亡基因轉錄的因子之一,可與Rel家族成員RelA/p65等結合形成同源或異源二聚體,通過抑制DNA結合活性而參與腫瘤發生發展中的增生、轉化、侵襲、藥物與放射性抵抗等多種生理病理過程[15];NF-κB抑制劑可通過抑制NF-κB活性而提高抗腫瘤藥物的敏感性,提高抗腫瘤效果[16]。結腸癌組織中NF-κB蛋白的表達水平升高,且結腸癌組織T分期越高,NF-κB蛋白表達水平越高,即NF-κB信號通路活性越高,腫瘤細胞侵襲性越強;降低NF-κB信號通路活性,可激活G蛋白偶聯膽汁酸受體5(G protein-coupled bile acid receptor 5,TGR5)而抑制結腸癌細胞的增殖、遷移;抑制化療耐受的異種腫瘤小鼠體內的NF-κB信號通路活性,可促使腫瘤細胞重新對化療敏感[17-18]。另外部分研究證實,絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶超家族成員IKK磷酸化后,p-IKK參與了NF-κB-p65等的激活反應,機體在受到外界刺激后, TNF-α、活性氧中間介質等表達水平升高,IKK被激活,繼而促使IκB蛋白磷酸化,識別DNA序列κB位點,參與轉錄的調節[19-20]。本研究結果顯示,隨著奧利沙鉑濃度的增加,結腸癌細胞存活率逐漸降低,且尤以轉染Nur77抑制物的Nur77抑制組結腸癌細胞存活率降低最,轉染Nur77的Nur77過表達組結腸癌細胞生存率最高,且轉染Nur77后的結腸癌細胞內NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白及其mRNA表達水平較其他各組細胞升高,而轉染Nur77抑制物的結腸癌細胞內NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白及其mRNA表達水平較其他各組細胞降低?？梢?Nur77的高表達可降低結腸癌細胞的藥物敏感性,且通過增加IKK、p-IKK的表達水平,進而提高NF-κB信號通路活性可能是其促進腫瘤細胞增生、降低結腸癌細胞藥物敏感性的主要作用機制;探索研究能夠調節Nur77—NF-κB信號通路活性的相關醫學干預手段對提高結腸癌患者的藥物敏感性具有重要的臨床意義,值得臨床進一步深入研究探討。

綜上所述,隨著奧利沙鉑濃度的增加,結腸癌細胞存活率逐漸降低,但轉染Nur77的結腸癌細胞存活率卻異常升高,Nur77的高表達可降低結腸癌細胞的藥物敏感性;且轉染Nur77的結腸癌細胞內NF-κB-p65、IKK、p-IKK表達水平也隨之升高,通過增加IKK、p-IKK的表達水平,進而提高NF-κB信號通路活性可能是其降低結腸癌細胞藥物敏感性的主要作用機制。