骨筋丸膠囊中血竭摻雜龍血竭鑒別研究

譚志偉，湯珺，張靜

1.吉安市食品藥品檢驗檢測中心，江西 吉安 343000；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

骨筋丸膠囊是由乳香、沒藥、血竭等14 味中藥組成的中藥成方制劑，血竭在組方中起著重要作用?！吨袊幍洹罚?］規定血竭的來源為棕櫚科植物麒麟竭果實滲出的樹脂加工而成。而龍血竭原植物則為百合科劍葉龍血樹［2］。二者收載于不同的標準，功效不完全相同，化學成分也有區別，其中血竭素、血竭紅素等為血竭的主要成分［3-5］；而龍血竭的主要成分為龍血素A、龍血素B 等二氫查耳酮類化合物和其他化合物［6-8］。由于兩者價格有差異，龍血竭較便宜，因此在中藥制劑生產過程中也不排除有些藥品生產企業為降低成本或在不知情的情況下，使用了龍血竭或摻雜有龍血竭的血竭投料的可能。

本次研究涉及12 家生產企業5 個質量標準，其中3 個檢驗標準缺少對血竭的質控項目，其余2個質量標準分別為《國家食品藥品監督管理總局國家藥品標準》WS3-B-2571-97-5［9］和WS3-B-2571-97-11［10］，均以薄層色譜法控制血竭質量，但檢驗過程中發現該薄層色譜法受溫度濕度影響較大，展開效果不理想，無法很好區分血竭和龍血竭，尤其無法區分骨筋丸膠囊中血竭摻雜龍血竭的情況。為了考察骨筋丸膠囊處方中的血竭是否按標準投料的情況，本研究經篩選指標以龍血素B 為檢測指標，建立了HPLC-DAD 法，對12 家生產企業47批次骨筋丸膠囊進行了龍血素B 的檢查。

1 儀器與試藥

安捷倫1260 高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司）；SQP 電子天平、AR-2140 電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

龍血素B 對照品（批號111558-201407，含量為99.9%，中國食品藥品檢定研究院）。水為超純水，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

61 批次骨筋丸膠囊（去除重復批號后為47 批次）均為2021 年江西省評價性抽檢樣品，涉及12個生產企業。陰性樣品為自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相；流速為1.0 mL/min；測定波長為277 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；按照表1 梯度洗脫。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 對照品溶液的制備

取龍血素B 對照品10.93 mg，精密稱定，置25 mL 棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含436.76 μg的龍血素B 標準貯備液。精密吸取龍血素B 標準貯備液適量，用甲醇稀釋成濃度為43.68 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取骨筋丸膠囊內容物，混勻，研細，取約1.5 g（約相當于血竭原藥材0.15 g），精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，密塞，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

為考察本方法的專屬性，試驗共自制以下三種溶液：（1）模擬血竭投料樣品溶液：取血竭適量，按照骨筋丸膠囊處方工藝制成相應的模擬制劑。按“2.3”項下方法制備成溶液，即得。（2）模擬龍血竭投料樣品溶液：取龍血竭適量，按照骨筋丸膠囊處方工藝，以龍血竭代替血竭投料，制成相應的模擬制劑。按“2.3”項下方法制備成溶液，即得。（3）骨筋丸膠囊中缺血竭陰性對照溶液：取處方中除血竭外的其余13 味藥材，按處方比例和制劑工藝制備不含血竭的陰性對照樣品，按“2.3”項下方法制備成缺血竭的陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果陰性樣品無干擾，色譜峰分離良好，表明該方法專屬性強，典型色譜圖（見圖1）。

圖1 高效液相色譜圖：A.龍血素B對照品溶液；B.模擬龍血竭投料樣品溶液；C.模擬血竭投料樣品溶液；D.供試品溶液（批號：190305）；E.缺血竭陰性對照溶液

2.6 線性關系考察

精密吸取龍血素B 標準貯備溶液適量，用甲醇制成濃度分別為174.70、87.35、43.68、21.84、8.74、3.49 μg/mL 的系列標準溶液。分別吸取上述標準溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積（Y）為縱坐標，相應的對照品濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為：Y=29.000X+14.355（r=1.000）。結果表明，龍血素B 在濃度3.49～174.70 μg/mL 范圍內與峰面積的線性關系良好。

2.7 精密度試驗

精密吸取龍血素B 對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，連續平行進樣6 次，計算龍血素B 峰面積的RSD 為0.01%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗

取同一份骨筋丸膠囊供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，計算龍血素B 峰面積的RSD為0.007%。結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.9 重復性試驗

分別取骨筋丸膠囊樣品（批號：190305）6 份，每份約1.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算龍血素B平均含量為0.820 3 mg/g,RSD 為0.70%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

取已知含量骨筋丸膠囊樣品（批號：190305）6份，每份約0.75 g，精密稱定，分別加入龍血素B標準溶液（濃度為218.38 μg/mL）3 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表2。由表2 可知，該方法準確度良好。

表2 龍血素B加樣回收率試驗結果（n=6）

2.11 47 批次樣品結果

對12 家生產企業的47 批次樣品進行了龍血素B 的檢查，結果有4 家企業共11 批次樣品中檢測出龍血素B。以現行質量標準中的薄層色譜法檢測合格的樣品中亦有檢測出龍血素B 的情況，測定結果見表3，檢出率為23.4%。提示部分生產企業可能存在以龍血竭代替血竭投料或以摻雜龍血竭的血竭投料的情況，需建立相應的檢驗方法對骨筋丸膠囊的中的血竭質量進行控制。

表3 47批次骨筋丸膠囊樣品測定結果 mg/g

3 討論

本研究通過HPLC-DAD 方法發現龍血竭和血竭藥材紫外光譜特征有差異。龍血竭主要特征成分為龍血素A、龍血素B 等。本研究嘗試以龍血素A作為檢測的指標性成分，但在實驗過程中發現龍血竭中的龍血素A（保留時間20.193 min）與血竭中的某一成分（保留時間20.098 min）色譜保留時間基本相同，但光譜最大吸收不同，龍血素A 在277 nm 處有最大吸收，血竭中的這一成分在290 nm 有最大吸收。將血竭和龍血竭以不同比例摻偽，發現當血竭里摻偽龍血竭比例比較大的情況下，可發現樣品在該保留時間的色譜峰在277 nm 波長處吸收最大，紫外吸收光譜與龍血素A 對照品一致。但當摻入龍血竭比例較少的情況下，色譜峰在290 nm下有最大吸收，與血竭中的這一色譜峰吸收光譜一致。因此以龍血素A 為鑒別特征，可能存在假陰性的情況。龍血竭中龍血素B 在277 nm 波長處也有最大吸收，而血竭在龍血素B 色譜峰（保留時間21.501 min）處無相應色譜吸收峰。因此本方法選用龍血素B 為指標性成分，建立了骨筋丸膠囊中龍血竭摻偽血竭的檢查方法，專屬性較好。

以本研究擬定的方法對47 批次骨筋丸膠囊進行檢測，有11 批次檢出龍血素B，檢出率高達23.4%，其中有2 批次檢出龍血素B 的樣品為按現行法定標準中薄層色譜法檢測合格的樣品。所以為了保障患者用藥安全性和有效性，應盡快完善現有質量標準，防止出現“合格的劣藥”的現象。

本實驗以龍血素B 為指標性成分采用HPLC 法進行快速篩查，同時采用DAD 檢測器結合色譜峰紫外光譜圖進行確證，能夠有效鑒別出骨筋丸膠囊中龍血竭代替血竭投料的情況，尤其是能夠鑒別出以摻雜龍血竭的血竭投料的情況。該方法具有直觀、可靠、專屬、可重復性等特點，能夠有效用于骨筋丸膠囊的血竭質量控制。