RP-HPLC 梯度洗脫法測定鹽酸金霉素有關物質方法研究

肖欽欽，張銀花，裴昆，陳希，段和祥，章紅江

西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

金霉素（chlortetracycline）為四環素類抗生素，被廣泛應用于多種細菌感染疾病的治療，對革蘭陽性、陰性細菌和衣原體、支原體、立克次體均有較強的抑制作用［1］。金霉素是人類從金色鏈霉菌中發酵得到的第一個天然四環素類抗生素［2-3］，該類抗生素因化學結構含有許多羥基、烯醇羥基及羰基導致其在酸性、堿性、中性、氧化等條件下均可降解形成多種降解雜質［4-5］，金霉素及其已知雜質的化學結構式如圖1 所示。金霉素屬于兩性化合物，等電點為pH 7.4，不易溶于水，能與各種酸、堿形成鹽，最常見的為鹽酸鹽。從國家藥品監督管理局網站查詢可知，鹽酸金霉素原料藥現有生產企業2 家，批文2 個，但僅一家企業仍在生產，其制劑有眼膏和軟膏2 種劑型，其中鹽酸金霉素眼膏占主要市場，臨床用于治療細菌性結膜炎、瞼腺炎、細菌性眼瞼炎及沙眼，但其質量狀況總體評價有待提高［6］。

圖1 金霉素和已知雜質的化學結構式

鹽酸金霉素現行質量標準《中國藥典》2020 年版［7］有關物質檢查方法無法有效控制產品質量，該方法采用等度洗脫液相色譜法，部分雜質無法洗脫出來，且雜質計算方法不合理，因此，鹽酸金霉素現行質量標準中有關物質測定方法亟待改善［8］。目前，國外藥典僅《英國藥典》（BP）［9］、《歐洲藥典》（EP）［10］收載了鹽酸金霉素有關物質檢查方法，以不同比例的高氯酸-二甲基亞砜-水體系作為流動相，采用超高效液相色譜（UPLC）進行梯度洗脫，除控制鹽酸四環素、4-差向金霉素（雜質A）兩個雜質外，還將雜質B、D、E、G、H、J、K、L 作為特定雜質分別予以控制。本研究參照BP 和EP 方法，采用高效液相色譜法，建立有關物質梯度洗脫法，以便更準確更有效地分析鹽酸金霉素原料藥的雜質狀況，從而為鹽酸金霉素制劑的質量控制提供保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MS 205DU 電子天平（德國梅特勒公司），LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司），LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試藥

鹽酸金霉素原料藥，共13 批，均為同一生產企業提供。對照品：鹽酸金霉素（批號：130489-201403，含量：94.1%），鹽酸四環素（批號：130488-201604，含量：98.4%），4-差向金霉素（批號：130404-201210，含量：90.1%），雜質D（4-差向四環素，批號：130401-200209，供系統適用性用），雜質I（脫水差向四環素，批號：130403-201205，含量：81.5%），均購于中國食品藥品檢定研究院。雜質E（批號：D230730，含量：90.0%），雜質B（批號：D0300000，含量：92.4%），雜質G（批號：1790000，含 量：96%），雜 質J（批 號：A1200000，含 量：93.0%），雜質K（批號：E578060，含量：95%），雜質L（批號：A637740，含量：90.39%），金霉素系統適用性對照品（批號：Y0001451，供系統適用性試驗用，包含雜質A、B、D、E、G、H、J、K、L），均為EP 對照品。

二甲基亞砜（TEDIA 公司，色譜純），甲醇、乙腈（Sigma-Aldrich 公司，色譜純），水為超純水，高氯酸、鹽酸等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Ultimate XB-C8 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為高氯酸-水-二甲基亞砜（16∶934∶525）（pH＜2.0），流動相B 為乙腈，流動相C 為甲醇，線性梯度洗脫；流速為0.8 mL/min；柱溫為45 ℃；檢測波長為280 nm；進樣量為20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 系統適用性試驗

取鹽酸金霉素對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加0.01 mol/L 鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，于80 ℃水浴中加熱30 min，放冷。精密量取該溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果各雜質色譜峰之間均能有效分離，分離度均大于1.5，見圖2。

圖2 系統適用性試驗色譜圖

2.3 溶液制備

2.3.1 稀釋劑的制備 取鹽酸0.9 mL，加水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取鹽酸金霉素原料藥約50 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3.3 對照品溶液（1）的制備 取鹽酸四環素對照品、4-差向金霉素對照品各適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 中分別含80 μg 與40 μg 的溶液。

2.3.4 對照品溶液（2）的制備 取鹽酸金霉素對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 中含鹽酸金霉素10 μg 的溶液。

2.3.5 靈敏度溶液的制備 精密量取對照品溶液（2）適量，用稀釋劑定量稀釋制成每1 mL 中含0.5 μg的溶液。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關系考察 取鹽酸金霉素對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解制成含鹽酸金霉素1 000、800、500、250、125、62、31 μg/mL 的系列標準曲線溶液；取鹽酸四環素對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解制成每1mL 中約含鹽酸四環素200、100、50、25、12、6、3 μg/mL 的系列標準曲線溶液；取4-差向金霉素對照品適量，精密稱定，加稀釋劑溶解制成每1 mL 中約含4-差向金霉素160、80、40、20、10、5、2 μg/mL 的系列標準曲線溶液。分別精密量取上述3 個成分的標準曲線溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。各成分以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），分別進行回歸分析。結果顯示，3 個成分的標準曲線在各自濃度范圍內均呈線性，見表2。

表2 線性關系考察結果

2.4.2 檢測限 取“2.4.1”項下各成分最低濃度水平線性溶液逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件進行液相色譜分析，以信噪比S/N ≥3 為檢測限，鹽酸金霉素檢測限為0.033 5 μg/mL，鹽酸四環素檢測限為0.077 9 μg/mL，4-差向金霉素檢測限為0.155 6 μg/mL。

2.4.3 重復性 取鹽酸金霉素原料藥，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件進行液相色譜分析，計算各雜質的百分含量，結果6 份供試品中各雜質含量基本無變化，RSD 均小于3.5%，見表3。說明該方法重復性較好。

表3 重復性試驗結果

2.4.4 準確度 取已知雜質含量的供試品6 份，各約25 mg，精密稱定，分別加入對照品溶液（1）適量，按“2.3.2”項下方法制備測試溶液，精密量取測試溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算回收率。2 種雜質回收率RSD 均小于1.5%，見表4，表明該方法的準確度較好。

表4 回收率試驗結果

2.4.5 專屬性 取供試品溶液分別進行以下試驗：（A）高溫降解，取供試品溶液5 mL，置100 ℃水浴中加熱15 min，冷卻；（B）光降解，取供試品溶液5 mL，在3 500 lx 光照強度下放置20 h；（C）堿破壞，取供試品溶液5 mL，加0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL，室溫放置5 min 后，加0.1 mol/L 鹽酸溶液1 mL，搖勻；（D）酸降解，取供試品溶液5 mL，加10 mol/L 鹽酸溶液2 mL，室溫放置30 min 后，加10 mol/L 氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻；（E）氧化降解，取供試品溶液5 mL，加30%過氧化氫溶液2 mL，搖勻，室溫放置2 d。吸取上述5 種降解溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結果顯示，鹽酸金霉素對高溫、堿、酸、氧化非常敏感。高溫條件下主要降解為4-差向金霉素、雜質J、雜質L；酸性條件下主要降解為雜質G、雜質J、雜質L；堿性條件下主要降解為雜質G；氧化條件下主要降解為雜質H。鹽酸金霉素經強制降解后，各雜質峰與主峰之間均能有效分離，表明方法的專屬性強。

2.4.6 穩定性試驗 取供試品溶液在室溫下放置，分別于不同時間（0、1、2、4、6、8、10、12 h）進樣分析，計算各雜質百分含量。結果顯示供試品溶液中4-差向金霉素含量變化RSD 為31.4%，增加約1.4倍；雜質J 和雜質L 含量呈增加趨勢；其他雜質含量變化均較小。說明供試品溶液不穩定，需臨用新制。

2.5 樣品測定

按“2.3”項下方法制備鹽酸金霉素供試品溶液、對照品溶液、靈敏度溶液，按“2.1”項下色譜條件對13 批鹽酸金霉素原料藥進行有關物質檢查，結果均檢出鹽酸四環素、4-差向金霉素、雜質B、雜質E、雜質J、雜質L，未檢出雜質D、G、H、I、K 及其他未知雜質。除鹽酸四環素含量為4.1%～5.2%，4-差向金霉素含量為0.9%～2.3%外，其他雜質總量為0.6%～1.0%，其中雜質B 含量為0.1%～0.4%，雜質E 含量為0.3%～0.6%，雜質J 含量為0.03%～0.07%，雜質L 含量為0.06%～0.15%，13 批原料藥批間差異較大，但均在擬定限度范圍內。

3 討論

3.1 流動相及系統適用性試驗的確定

通過降低流動相中二甲基亞砜比例，并調節甲醇、乙腈比例進行梯度洗脫的方法，可明顯解決現行質量標準中高比例的二甲基亞砜易致系統超壓且色譜峰保留時間漂移大、等度洗脫難以將雜質完全洗脫出來以致雜質殘留加快色譜柱柱效降低等問題。

利用鹽酸金霉素對照品進行熱降解，采用單個雜質對照品對各雜質峰進行定位，結果顯示該降解溶液色譜圖中主要雜質峰與BP 或EP 中系統適用性對照品中雜質峰一致，鹽酸金霉素及其11 個已知雜質均能有效分離，確定了系統適用性試驗方法及要求。

3.2 各雜質計算方法及限度的確定

BP 或EP 收載的鹽酸金霉素原料藥有關物質雜質計算方法，鹽酸四環素采用外標法計算不得過6.0%；雜質G、J、K、L 采用加校正因子（依次為1.4、0.3、0.4、0.4）主成分外標法計算，依次不得過0.2%、0.3%、0.15%、0.2%；雜質A、B、D、E、H 均采用不加校正因子主成分外標法計算，依次不得過4.0%、1.0%、0.2%、1.0%、0.2%，其他單個雜質不得過0.10%，雜質拋棄限為0.05%，各雜質總和（除鹽酸四環素、雜質A 外）不得過2.0%。

對原料藥中檢出的雜質J、L 按現行質量標準方法計算含量分別為0.1%～0.3%、0.2%～0.5%，平均含量為0.2%、0.3%，雜質J 含量大于0.2%的樣品率為38.5%，雜質L 含量超出BP 或EP 限度樣品率為92.3%，顯然該計算方法不合理。本研究考察了雜質J、K、L 的相對校正因子，結果差異甚小，因此相對校正因子及限度均參照BP 和EP；雜質G 在原料藥及制劑中均未檢出，不作為特定雜質進行控制；其他雜質除雜質E 限度一致外，雜質B（不得過0.5%）和雜質D、H、I、K（均不得過0.1%）限度均低于BP 或EP 標準；鹽酸四環素和雜質A 計算方法與限度仍參照現行質量標準，以更嚴格的標準控制國內鹽酸金霉素原料藥的質量。