冬季農田不同深度土層及小麥根際土壤細菌群落結構和共現網絡分析

田澤遠，張俊霞，張文俊，劉 彪，顧效綱，胡紅偉

（1.河南城建學院河南省水體污染防治與修復重點實驗室，河南 平頂山 467036；2.江西理工大學資源與環境工程學院，江西 贛州 341000）

土壤細菌多樣性對維持生態系統功能至關重要。土壤細菌群落具有驅動地球化學循環、分解有機物、抑制土傳疾病和促進植物生長等功能［1］。影響土壤細菌群落結構的因素有很多，如pH、有機質、氨和磷等［2］。土壤細菌群落的組成與土壤深度也相關。在土壤深處，細菌可利用的養分有限，生物量隨著深度增加呈指數下降［3］，但某些細菌的潛在活性可能高于表層土壤［4］。此外，即使在相隔幾微米至幾毫米的土壤環境中，物理和化學性質、細菌豐度、群落組成和細菌活性也可能存在較大差異［5］。

植物根際是土壤細菌進行物質轉化、營養吸收的重要場所。根際細菌有助于植物在養分同化之前將其轉化為可用的形式［6］。同時，植物根系能夠產生如氨基酸、有機酸、糖類和次生代謝產物等物質，被土壤細菌用于供能和生物量生產，從而促使更多有益細菌在土壤中定殖，形成密集復雜的根際微生態［7］。植物－土壤反饋是細菌群落結構的重要決定因素，尤其在農業土壤生態系統中。Fan等［8］通過對小麥根際細菌的研究發現，非根際土壤和根際土壤的細菌群落組成差異顯著，并且細菌多樣性與根系的距離成反比。此外，與非根際土壤相比，根際細菌共現網絡結構相對簡單［9］。

冬季是小麥休眠期，小麥停止生長后，將營養成分儲存在根部，為春季返青提供足夠養分，這一過程對小麥產量至關重要。研究這一時期農田土壤及小麥根際土壤微生物種群結構及共現網絡關系，將有助于深入了解冬季小麥根際微生態及其響應機制。本研究選擇河南省平頂山市汴城村附近農田土壤及小麥根際土壤為研究對象，使用Illumina Miseq平臺進行高通量測序，選擇16SrRNA V4區進行PCR擴增，對細菌群落的多樣性及組裝機制進行了探究。

1 材料與方法

1.1 采樣區域概況與樣品采集

采樣點位于河南省平頂山市汴城村附近農田（33°40′53.05＂N，113°17′15.17＂E），該區域屬大陸性季風氣候，年降水量500～600 mm。農田為多年小麥－玉米連作耕地，土壤類型為褐土，質地為壤質土。2020年1月，采用五點取樣法，使用直徑為5.5 cm的空心桿手動螺旋鉆采集垂直深度為0～20 cm的農田土壤樣品，標記為非根際（FG）樣品（0≤FG－A≤5 cm、5＜FG－B≤10 cm、10＜FG－C≤15 cm、15＜FG－D≤20 cm），在各點附近采集小麥根際土壤，標記為GJ樣品（GJ：4～10 cm）。將同類型土壤樣品混合均勻后，分為兩份，樣品保存于－40℃超低溫冰箱。

1.2 土壤樣品理化性質測定

土壤樣品自然風干并過100目篩網后用于理化參數測定。參照《土壤農業化學分析方法》［10］測定土壤中的氨氮（NH＋4－N）、硝酸鹽（NO－3－N）、亞硝酸鹽（NO－2－N）、總磷（TP）和總有機碳（TOC）。采用濃H2SO4－H2O2法消解，使用凱氏定氮儀（KjeFlex K360，Switzerland）測定土壤凱氏氮（TKN）。采用電位法，使用pH計（Hanna HI98130，Italy）測量pH值。

1.3 PCR擴增和高通量測序

稱量0.1 g土樣，采用E.Z.N.ATMMag－Bind Soil DNA Kit試劑盒提取土壤樣品DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，采用紫外分光光度計進行定量測定。利用16S rRNA V4區引物進行PCR擴增，引物序列分別為515F（5′－GTGCCAGCMGCCGCGGTAA－3′）和806R（5′－GGACTACVSGGGTATCTAAT－3′）。使用Illumina Miseq平臺進行高通量測序，高通量測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本研究所獲數據已上傳至NCBI，SRA序列號為PRJNA776557。

1.4 數據分析

基于97%相似度，使用Usearch 7.1對高通量測序結果進行OTU（Operational Taxonomic Unit）分類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU代表序列［11］。使用Mothur 1.30.1進行細菌群落Alpha多樣性分析。使用R的vegan包進行細菌群落Beta多樣性分析和冗余分析（RDA）。使用SPSS25.0對數據進行皮爾遜線性相關性分析。使用R的hmisc和igraph包分析細菌群落之間的相關性，并使用Gephi 0.9.2（R＞0.6，p＜0.05）進行網絡可視化。利用Excel 2019進行實驗數據的統計與計算。

2 結果

2.1 土壤樣品理化性質

土壤理化參數如圖1所示。土壤pH值介于4.33～5.81，呈酸性，并隨土壤深度增加而增加。TOC含量在各樣品之間存在顯著差異（p＜0.05），且隨土壤深度的增加而減少，GJ中含量最高。TP含量在各樣品之間差異不顯著，介于1.40～1.60 g／kg。NO－2－N和NO－3－N含量最高值分別出現在FG－D（22.4 mg／kg）和FG－B（6.91 g／kg），均顯著高于其他樣品（p＜0.05）。GJ樣品中NH＋4－N和TKN含量均顯著高于其他樣品（p＜0.05），分別為58.4 mg／kg和0.72 g／kg，并隨土壤深度增加而減少。

圖1 土壤樣品理化參數

2.2 土壤樣品細菌多樣性

土壤樣品Alpha多樣性指數如表1所示。文庫覆蓋率均大于94%，說明取樣合理，樣本OTU覆蓋度已經趨近飽和。GJ樣品OTU數目最少，最高值出現在FG－C。香農指數最低值和辛普森指數最高值均出現在GJ，表明GJ樣品中細菌多樣性最低。根據香農指數和辛普森指數變化趨勢，可知細菌多樣性隨著土壤深度增加而增加。此外，基于OTU的樣本聚類樹分析（見圖2），不同樣本細菌群落可分為兩個大類，即GJ、FG－A和FG－B聚類，FG－C和FG－D聚類。

表1 土壤樣品Alpha多樣性指數

圖2 基于OTU的樣本聚類圖

2.3 土壤樣品細菌群落組成

基于門水平的微生物群落相對豐度前10的物種，繪制物種相對豐度柱狀圖（見圖3（a））。變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）在所有樣品中均為優勢菌門。其中，變形菌門在GJ（38.79%）、FG－A（51.03%）和FG－B（40.58%）中豐度最高；酸桿菌門在FG－C（30.58%）和FG－D（31.65%）中豐度最高。相較于農田土壤柱狀樣，小麥根際土壤樣品中放線菌門的豐度明顯高于土壤柱狀樣中放線菌門的豐度，而酸桿菌門則相反。此外，在柱狀樣中，變形菌門和擬桿菌門的豐度隨土壤深度增加而減少，而酸桿菌門則呈相反趨勢。

基于屬水平的微生物群落相對豐度前20的物種，繪制物種相對豐度柱狀圖（見圖3（b））。Gp6、節桿菌屬（Arthrobacter）、Gp4、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）是所有樣品中的優勢菌屬。其中，節桿菌屬在GJ（19.21%）中豐度最高，芽單胞菌屬在FG－A（4.59%）中豐度最高，屬于酸桿菌門的Gp6在FG－B（5.21%）、FG－C（34.79%）和FG－D（37.53%）中豐度最高。相較于農田土壤柱狀樣，小麥根際土壤樣品中節桿菌屬的豐度最高，而Gp6的豐度最低。此外，在柱狀樣中，Gp6的豐度隨土壤深度的增加而增加，而Gp4的豐度則隨土壤深度的增加呈現出先增加后降低的趨勢。

2.4 土壤細菌群落結構與環境因子的相關性分析

對土壤細菌群落結構與環境因子進行RDA分析（見圖4），RDA1解釋總變異量的69.26%，RDA2解釋總變異量的26.38%，二者共同解釋了細菌群落變異量的95.64%，能夠較好地反映出微生物群落與環境因子之間的相互關系。由圖4可知，樣品GJ、FG－C和FG－D細菌群落與pH呈正相關，且FG－C和FG－D聚類。FG－A、FG－B細菌群落與pH呈負相關，與TKN、TOC和NH＋4－N呈正相關。

圖4 細菌群落與環境因子之間的RDA分析

2.5 細菌群落共現網絡分析

使用共現網絡分析評估前150 OTUs的細菌相互作用（見圖5）。該網絡生成了98個節點和1 527條邊，平均度為31.16，網絡直徑為9，模塊度為1.27，平均聚類系數為0.76，平均路徑長度為3.67（見圖5（a））?；陲@著的斯皮爾曼相關性（ρ＞0.6，p＜0.05），總共預測了7個模塊（見圖5（b））。每個節點的大小與連接程度成正比；邊的粗細與斯皮爾曼相關系數成正比。綠色線表示顯著負相關，紅色線表示顯著正相關。節點越大，表明它與其他節點關聯越多，連線越寬，表明兩節點之間的相關性越強?；诖?，與其他10個以上節點有緊密聯系的OTU被定義為關鍵分類群，表明它們在每個細菌群落的組成和功能方面均具有重要的作用（見圖5（b））。本研究中，Povalibacter、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Gp6、Gp4、Gaiella、Subtercola等節點是網絡主要模塊中最重要的基礎單元分類群，表明這些細菌為細菌群落中的優勢細菌并在其中起關鍵作用（見圖5（a））。

圖5 基于全部土壤樣本中前150個OTUs的共現網絡圖

3 討論

樣品采集區域土壤為褐土，與其他類型土壤相比，褐土有機質和全氮含量比較低。對于作物而言，褐土缺乏氮素營養［12］，在作物播種前一般需對農田施肥。本研究中5個土壤樣品pH值介于4.33～5.81，呈酸性。這主要是因為農田土壤長期施用氮肥，在氮肥轉化為硝酸鹽的過程中，導致土壤中Ca、Mg等堿性離子流失，從而引起土壤pH降低［13］。理化性質和空間分布能夠極大地影響細菌群落的組裝，從而導致細菌群落豐富度和多樣性的差異［14］。由RDA分析可知，FG－A在TKN、TOC、NH＋4－N上的投影距箭頭較近，表明FG－A中細菌群落對土壤中TKN、TOC、NH＋4－N的響應較為敏感，而GJ在pH上的投影距箭頭較近，表明pH對GJ中細菌群落結構影響較大。

結果表明，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和厚壁菌門為優勢菌門，這與Li等［15］和Chang等［16］對農田的研究結果一致。不同于非根際土壤樣品，在小麥根際土壤中，變形菌門豐度最高，其次為放線菌門，與Fan等［17］的研究結果相似。此外，變形菌門在FG－A和FG－B中豐度最高。一般認為變形菌和放線菌是富營養型細菌，對土壤中C、N循環有顯著的促進作用［18］。植物根際土壤細菌群落結構常表現出與非根際土壤之間的顯著差異，而本研究中基于OTU的樣本聚類結果顯示，GJ、FG－A和FG－B之間相互聚類，表明它們的細菌群落結構特征相似，可能是因為小麥在冬季處于休眠期，根系分泌物較少，對根際細菌的影響有限［19］，且該時期小麥根系長度約為10 cm，與FG－A和FG－B土壤樣品處于同一深度?？梢?，本研究中土壤深度是冬季農田土壤細菌群落結構的主要影響因子。

隨著土壤深度的變化，土壤中細菌種群結構和數量也會發生改變［20］。本研究中，農田土壤柱狀樣品中的變形菌門和酸桿菌門的相對豐度隨土壤深度增加呈現出獨特的變化趨勢。酸桿菌門的相對豐度隨土壤深度增加逐漸增加，而變形菌門則相反。這是由于變形菌門大多由異養細菌構成，適合在C、N含量豐富的環境中生存［21］，而酸桿菌門被認為是寡營養細菌，主要生存在營養不良且有機碳濃度較低的酸性環境中［22］。本研究的土壤理化參數結果顯示，隨土壤深度的增加，NH＋4－N和TOC含量減少，故變形菌門和酸桿菌門相對豐度隨土壤深度呈相反趨勢。

Griffiths等［23］對英國各地超過1 000個土壤剖面樣品中細菌群落的多尺度空間分布進行了研究，發現pH值與酸桿菌門豐度呈反比，Rousk等［24］的研究也得出類似結論。本研究結果顯示，酸桿菌門的豐度隨著pH值的增加而增加。土壤pH是影響酸桿菌豐度和多樣性的重要環境因子，但其他環境因素不可忽視。本研究中，pH值隨土壤深度的增加呈遞增趨勢，但NH＋4－N、TOC和TKN的含量則隨之降低，形成了相對寡營養的環境，為寡營養細菌酸桿菌門營造了適宜的生存環境。Barns等［25］研究發現，大量酸桿菌門亞群在低pH環境中不適宜生存，也會導致酸桿菌門總豐度減少，Jones等［26］的研究結果也證實了該發現。在屬水平上，節桿菌屬是GJ的主要優勢菌屬。節桿菌被認為是專性好氧菌，植物根系的泌氧作用促進了節桿菌在小麥根際土壤中的富集。另一方面，隸屬于酸桿菌門的亞群Gp6、Gp4和Gp1的相對豐度隨pH值呈現出不同趨勢，其中Gp6和Gp4的相對豐度隨pH值呈現正相關趨勢，而Gp1相對豐度隨pH值呈現負相關趨勢，這與Turlapati等［27］對30個土壤樣品中的酸桿菌亞群的研究結果相似。

共現網絡分析揭示了細菌之間的相互作用，能夠對細菌結構和組裝模式進行全面的了解。其中，高度相關的基礎單元分類群對細菌群落的功能起著關鍵作用［28］。本研究表明，在具有緊密聯系的不同微小生境中，細菌組成以及細菌間的相互作用均具有獨特性。例如，在Module 1中存在大量的變形菌門和少量的酸桿菌門和放線菌門細菌，其中伯克霍爾德菌屬（Burkholderia），戴氏菌屬（Dyella），馬賽菌屬（Massilia）在Module 1中起著關鍵作用。伯克霍爾德菌屬因其具有生物防治效果并且能夠促進植物生長而被大量報道［29］。戴氏菌屬為兼性厭氧細菌，能夠將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，促進反硝化進程［30］。馬賽菌屬廣泛存在于植物根際環境中，能夠增強植物抗逆性，還具有降解多環芳烴的功能［31］。在Module 2中，酸桿菌門占據較高的豐度，特別是Gp6和Gp4兩個亞群，Navarrete等［32］的研究也得出類似的結論。此外，本研究發現，在Module 1與Module 2交界處存在大量的顯著負相關，而這兩個Module內部則存在大量的顯著正相關，表明Module 1與Module 2之間可能存在著競爭關系，而在各自內部各節點之間存在緊密的合作關系。

4 結論

（1）對農田不同深度土壤（0≤FG－A≤5 cm、5＜FG－B≤10 cm、10＜FG－C≤15 cm、15＜FG－D≤20 cm）及小麥根際土壤（GJ）的細菌群落結構進行了研究。在門水平上，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和厚壁菌門為優勢菌門；在屬水平上，節桿菌屬在小麥根際土壤中占據優勢，Gp6則在柱狀土壤中占據優勢。

（2）酸桿菌門相對豐度隨土壤pH值的增加而增加。RDA分析結果表明，TKN、TOC、NH＋4－N和pH是影響細菌群落結構特征差異的關鍵環境因子。此外，基于OTU的樣本聚類樹分析，表明GJ、FG－A和FG－B相互聚類。

（3）共現網絡分析表明，不同模塊的細菌組成以及細菌間的相互作用均有所差異。Module 1和Module 2內部各節點之間存在大量合作關系，但Module 1與Module 2之間處于競爭狀態。