茵陳五苓散對濕重于熱型阻塞性黃疸膽道術后T 細胞亞群的影響

韓樹旺,尚海濤,張德林,郝成飛,劉軍艦

（天津市中西醫結合醫院肝膽胰外科，天津 300100）

阻塞性黃疸（obstructive jaundice，OJ）也稱為外科黃疸，是常見的外科疾病[1-2]。由于膽管的機械性梗阻引起膽汁流入腸道障礙，造成膽汁淤積，導致膽道內壓力增高，膽汁通過肝細胞和毛細膽管逆行入血，從而可導致血中膽紅素水平升高引起皮膚黏膜及鞏膜黃染等一系列臨床綜合癥狀，且圍手術期有較高的并發癥發生率及病死率[3-5]。研究表明，OJ發生期間由于膽道梗阻可導致膽汁淤積、機體免疫功能紊亂等一系列病理生理變化[6]。有關報道指出膽總管結石是OJ 最常見的良性原因[7]。OJ 免疫功能受損是大部分并發癥的原因，緣于腸肝軸和全身內毒素血癥的動態平衡紊亂[8]。而OJ 引起的機體免疫功能變化主要表現為細胞免疫，高膽紅素血癥、高膽汁酸血癥、內毒素血癥等改變是機體OJ 時細胞免疫功能受損的原因。細胞ATP 酶、蛋白激酶，線粒體功能可被膽紅素抑制，同時膽紅素可改變細胞膜的通透性，淋巴細胞膜的結構和功能可以被高濃度的膽汁酸或膽鹽直接損害[9-10]。及時解除病因使膽道再通是治療本病的關鍵所在，探索有效且安全可靠的聯合治療方式顯得格外重要。大量研究表明祖國醫學對黃疸的治療在利膽減黃保肝、改善機體細胞免疫功能方面有獨特的優勢[11-13]。本研究通過隨機對照試驗探討清熱利濕方——茵陳五苓散對因膽總管結石所致OJ 患者膽道術后細胞免疫功能的影響。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2021 年6 月至2022 年3 月天津市中西醫結合醫院肝膽胰外科收治的結石性阻塞性黃疸患者76 例，隨機分為觀察組（加用茵陳五苓散顆粒劑）與對照組各38 例，觀察期間觀察組1 例因個人原因而脫出，最終觀察組共完成研究37例，對照組38 例。觀察組平均年齡59（50，64）歲，男性14 例，女性23 例，美國麻醉醫師分級（ASA）Ⅰ級19 例、Ⅱ級18 例；對照組年齡54（44.25，62.25）歲，男性13 例，女性25 例，ASA 分級Ⅰ級24 例、Ⅱ級14 例。所納入患者均因膽總管結石造成的梗阻且術前有黃疸癥狀，參考張仲景《金匱要略黃疸病篇并治第十五》《中醫內科學》（人民衛生出版社第2版）濕重于熱型黃疸常見癥狀制定中醫辨證標準：主癥：（1）身目發黃如橘。（2）嗜臥乏力，頭重身困。（3）無發熱或身熱不揚。次癥：（1）右脅疼痛，脘悶腹脹。（2）納呆便溏，厭食油膩。（3）惡心、嘔吐。（4）口黏不渴，小便不利。（5）舌苔厚膩微黃，脈弦滑或濡緩。證型診斷評判標準為主癥（≥2 項）加次癥（≥2項），同時結合舌脈象。所有患者行膽總管探查取石術或內鏡取石術解除梗阻。本研究通過了天津市中西醫結合醫院倫理委員會審批（批件號：NKYY_YXKT_IRB_2019_004_01），所有受試者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 納入和排除標準 納入標準：（1）術前確診為膽總管結石造成的OJ 患者。（2）膽道術后患者。（3）中醫證型診斷為濕重于熱證者。（4）年齡在18～75 歲，有獨立行為能力者。（5）同意配合治療者。排除標準：（1）肝細胞性黃疸患者。（2）肝自身免疫性疾病患者。（3）伴有嚴重心、肝、腎等重要臟器疾病，不耐受麻醉、手術患者。（4）服用過肝臟毒性藥物的患者。（5）惡性梗阻性黃疸患者。

1.2.2 治療方法 對照組：西醫常規治療：（1）術后禁食。（2）術后給予抗感染。（3）術后糾正水、電解質和酸堿平衡及營養支持等。（4）術后止痛：根據患者情況可給予鹽酸布桂嗪、氯諾西康、哌替啶等止痛藥物。（5）術后合并癥處理：對合并有其他基礎病，如糖尿病、冠心病、高血壓等，可采取相應的西醫治療措施。（6）為避免試驗干擾，不加用其他如穴位敷貼、針灸、紅外線照射等中醫治療措施。

觀察組：在西醫常規治療的基礎上，術后第1天開始加用茵陳五苓散（顆粒劑）（顆粒劑由天津市南開醫院顆粒藥房制備）。方藥：方劑為茵陳五苓散（顆粒劑）（此方出處《金匱要略黃疸病并治第十五》）：茵陳30 g、澤瀉25 g、豬苓15 g、茯苓15 g、白術15 g、桂枝10 g。服用方法：1 袋/次，2 次/d，早晚200 mL 溫開水沖服或胃管注入。

1.2.3 標本收集及檢測 收集患者術前1 d、術后5 d、術后7 d 清晨空腹狀態下外周靜脈血，于精準醫學科檢驗室檢測CD3+T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、CD4+CD25+Treg 細胞水平，剩余血液樣本給予3 000 r/min 離心10 min 將血清和紅細胞分離，血漿至于ETDA 抗凝管內予以3 000 r/min 離心30 min 取上清，按檢測白細胞介素（IL）-10、轉化生長因子（TGF）-β1一次用量分裝，凍存于-20℃，待統一用ELISA 試劑盒檢測。

1.2.4 試劑、儀器 鼠抗人抗體CD3-perCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-APC（BD 公司，美國）；IL-10 ELISA 試劑盒（巧伊生物，安徽巧伊生物科技有限公司，中國）；TGF-β1ELISA 試劑盒（proteintech 公司，美國）；日本久保田KUBOTA 血液離心機（型號：KA-220，上海創萌生物科技有限公司，中國）；流式細胞儀（型號：FACSCalibur，Beckman Coulter公司，美國）；MR-96A 全自動酶標儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，中國）。

1.2.5 流式細胞術檢測 T 淋巴細胞亞群水平：（1）檢測CD4+CD25+Treg 細胞：取EDTA-K2 抗凝血40 μL，加入CD4-FITC 和CD25-APC 熒光抗體5 μL，同型對照管另取40 μL 血加入IgG1-FITC、IgG2a-APC 熒光抗體5 μL，混勻，室溫避光孵育20 min，加入2 mL 溶血劑，加PBS 緩沖液2 mL 重懸細胞，1 800 r/min 離心5 min，棄上清，再加PBS 緩沖液2 μL，上流式細胞儀檢測并計數，以“CD4+CD25+”雙陽性細胞表示CD25+T 淋巴細胞。（2）另取ETDA-K2抗凝血40 μL，加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-perCP熒光抗體5 μL，同型對照管另取40 μL 血加入IgG1-FITC/IgG1-pE/IgG1-perCP 抗體5 μL，其他條件同CD4+CD25+Treg 細胞，流式細胞儀檢測并計數，以“CD3+”陽性表示CD3+T 淋巴細胞；“CD3+CD4+”及“CD3+CD8+”均為雙陽性細胞分別表示CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞。

1.2.6 ELISA 檢測血清IL-10、TGF-β1濃度 （1）取出已經平衡室溫的試劑、酶標板。（2）加樣，分別設零孔、標準孔、待測樣品孔，零孔加樣樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL。（3）酶標板加上蓋或覆膜，濕盒放置，37℃孵育120 min。（4）洗滌：用洗滌液洗滌板條4 次，每孔350～400 μL，使用毛巾或者濾紙將板內殘留液體拍出，最后一次洗滌后確保板內無殘留液體，避免毛巾或濾紙纖維進入板內。（5）每孔加100 μL 檢測抗體，蓋上封板膜，濕盒放置，37℃孵育60 min。重復步驟4。（6）每孔加100 μL HRP 標記抗體，蓋上封板膜，濕盒放置，37℃孵育40 min。重復步驟4。（7）顯色：每孔加TMB 顯色液100 μL，37℃（不需要置于濕盒環境）避光顯色15～20 min。（8）終止：每孔加終止液100 μL，加樣后5 min 讀數。（9）在Excel 工作表中以OD 值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準品曲線，對照未知樣本中OD 值，按照曲線方程即可計算出標本中IL-10、TGF-β1濃度。

1.3 統計學處理 采用SPSS 26.0 統計軟件進行統計分析。所有計量資料經正態性檢驗后符合正態分布，均以表示，組間采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗；非正態分布計量資料以中位數和四分位數間距[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，計數資料以例數、構成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料及脫失情況比較 兩組性別、年齡、是否合并高血壓、糖尿病、冠心病、是否合并腹部手術史、ASA 分級等一般資料比較差異均無統計學意義（均P>0.05），見表1。

表1 兩組患者一般資料比較[（n）%，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients[（n）%，M（P25，P75）]

2.2 兩組患者治療前后CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+Treg 細胞變化 兩組患者治療5 d、7 d，CD3+、CD4+T 淋巴細胞、CD4+/CD8+比值均較術前1 d 增加，CD4+CD25+Treg 細胞較術前1 d 減少，差異均有統計學意義（均P<0.05）；與對照組相比，術后5 d、7 d CD3+、CD4+T 淋巴細胞、CD4+/CD8+比值升高，CD4+CD25+Treg 細胞減少，差異均有統計學意義（均P<0.05），兩組組內、組間CD8+T 淋巴細胞比較均無統計學差異（均P>0.05），見表2～6。

表2 兩組治療前后血清CD3+T 淋巴細胞的變化（，%）Tab.2 Changes of serum CD3+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

表2 兩組治療前后血清CD3+T 淋巴細胞的變化（，%）Tab.2 Changes of serum CD3+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：與術前1 d 相比，aP<0.05

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表3 兩組治療前后血清CD4+T 淋巴細胞的變化（，%）Tab.3 Changes of serum CD4+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

表3 兩組治療前后血清CD4+T 淋巴細胞的變化（，%）Tab.3 Changes of serum CD4+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：與術前1 d 相比，aP<0.05

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表4 兩組治療前后血清CD8+T 淋巴細胞的變化（，%）Tab.4 Changes of serum CD8+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

表4 兩組治療前后血清CD8+T 淋巴細胞的變化（，%）Tab.4 Changes of serum CD8+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：與術前1 d 相比，aP<0.05

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表5 兩組治療前后CD4+/CD8+的變化（）Tab.5 Changes of CD4+/CD8+before and after treatment in two groups（）

表5 兩組治療前后CD4+/CD8+的變化（）Tab.5 Changes of CD4+/CD8+before and after treatment in two groups（）

注：與術前1 d 相比，aP<0.05

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表6 兩組治療前后血清CD4+CD25+Treg 細胞的變化（，%）Tab.6 Changes of serum CD4+CD25+Treg cells before and after treatment in two groups（，%）

表6 兩組治療前后血清CD4+CD25+Treg 細胞的變化（，%）Tab.6 Changes of serum CD4+CD25+Treg cells before and after treatment in two groups（，%）

注：與術前1 d 相比，aP<0.05

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2.4 兩組患者治療前后IL-10、TGF-β1變化 術后5 d、7 d，與對照組比較，IL-10、TGF-β1降低較明顯，差異有統計學意義（均P<0.05）；與術前1 d 比較，兩組術后5 d、7 d，IL-10、TGF-β1降低，差異有統計學意義（均P<0.05），見表7、8。

表7 兩組治療前后TGF-β1 濃度變化（，pg/mL）Tab.7 Changes of TGF-β1 concentration before and after treatment in two groups（，pg/mL）

表7 兩組治療前后TGF-β1 濃度變化（，pg/mL）Tab.7 Changes of TGF-β1 concentration before and after treatment in two groups（，pg/mL）

注：與術前1 d 相比，aP<0.05；TGF：轉化生長因子

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表8 兩組治療前后IL-10 變化（，pg/mL）Tab.8 Changes of IL-10 before and after treatment in two groups（，pg/mL）

表8 兩組治療前后IL-10 變化（，pg/mL）Tab.8 Changes of IL-10 before and after treatment in two groups（，pg/mL）

注：與術前1 d 相比，aP<0.05；與對照組術后5 d、7 d 相比，bP<0.05；IL：白細胞介素

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3 討論

OJ 是常見的外科疾病，是多因素共同作用的結果，其中最常見的良性原因是由膽總管結石引起[7，14]。膽道梗阻可引起高膽紅素血癥、內毒素血癥的發生，導致圍手術期并發癥發病率增加、免疫功能受損、全身多器官功能損害、營養障礙等。既往研究發現茵陳五苓散對OJ 機體細胞免疫功能具有改善作用，增強機體抗感染能力。茵陳五苓散最早出自張仲景的《金匱要略·黃疸病》，其屬于經典方劑，在清熱利濕、利膽退黃方面一直備受推崇。其中君藥茵陳，具有清熱利濕功效；澤瀉、茯苓、豬苓具有利水滲濕的功效；白術具有健脾燥濕的功效；桂枝具有通陽化氣行水的功效，諸藥相配伍共湊清熱利濕、利膽退黃功效?，F代藥理研究發現，茵陳五苓散的化學成分主要是香豆素、多糖類、萜類及揮發油，具有抗脂質過氧化以及減黃保肝的功效，同時對化學物質導致的肝損傷具有保護作用，可促進肝再生，調節細胞免疫[15-17]。

OJ 患者因膽汁淤積、高膽紅素血癥等因素對機體免疫功能產生了影響，尤其細胞免疫功能被抑制。本研究觀察結果發現，OJ 患者通過手術有效解除梗阻之后可以改善免疫功能，觀察組聯合茵陳五苓散可以加快機體細胞免疫功能恢復。在本研究中兩組患者在膽道術后治療5、7 d，CD3+T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞、CD4+/CD8+比值均較術前1 d 增加，CD4+CD25+Treg 細胞較術前1 d 減少；術后5、7 d觀察組和對照組組間比較顯示，CD3+、CD4+T 淋巴細胞、CD4+/CD8+比值變化差異有統計學意義，說明聯合茵陳五苓散治療可加快改善細胞免疫功能，且治療時間越長對改善細胞免疫功能的作用越明顯。CD8+在觀察組及對照組組內、組間各時間段比較差異均無統計學意義，提示CD8+T 淋巴細胞在OJ 病理過程中數量無明顯變化。而CD4+/CD8+術前術后變化顯著，說明CD4+/CD8+越高，T 細胞免疫應答能力越強，提示對照組患者術后細胞免疫功能恢復慢于觀察組。這與先前的研究相一致[12，18-19]。

TGF-β1、IL-10 是由Treg 細胞分泌的抑制性細胞因子，通過細胞因子發揮免疫抑制功能。研究發現通過某種手段降低OJ 患者Treg 細胞的表達進而減少TGF-β、IL-10 的表達，Treg 細胞在其體內所介導的免疫抑制效應將可能降低甚至逆轉，從而在提高OJ 患者免疫功能，降低并發癥發生率、提高治療效果和改善預后方面發揮積極作用[20-21]。既往研究證實中醫藥可以改善OJ 患者機體免疫細胞功能，主要表現為Treg 細胞數量減少，本研究結果顯示，細胞因子TGF-β1、IL-10 隨Treg 細胞變化而變化，說明茵陳五苓散在細胞免疫恢復方面起到了積極的輔助作用，且對照組慢于觀察組。

綜上所述，本研究通過臨床隨機對照觀察發現，利用外科手術可有效解決膽道梗阻問題，術后聯合茵陳五苓散能在保證安全的前提下，加快利膽減黃，恢復機體細胞免疫，中西醫憑借各自的優勢，相互補充，加快患者術后恢復。中醫藥可以作為OJ圍手術期的重要輔助措施，并且安全可靠，值得臨床推廣。