miR-129-5p 通過靶向SALL4 抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的實驗研究

張華，范松，劉冀琴，張學軍

（1.天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津 300070；2.武警特色醫學中心檢驗科，天津 300162；3.武警河北省總隊醫院檢驗科，石家莊 050000）

肝細胞癌（HCC）是最常見的原發性肝癌類型，也是全球癌癥相關死亡的第四大原因[1]。在大多數情況下，HCC 是由肝硬化肝臟的慢性炎癥發展而來，并與乙型和丙型病毒性肝炎感染、長期飲酒或攝入黃曲霉毒素等病因相關[2]。大多數患者確診時已處于晚期，可選擇的治療方案非常有限。目前，手術切除仍是HCC 的主要治療手段，但高達70%的HCC 患者在接受手術切除5 年后復發[3]，此外，對于大多數晚期HCC 患者，索拉非尼似乎是臨床上最有效的化療藥物，但其使用和功能受到許多不確定因素的限制[4]。因此，HCC 的總體5 年生存率低于18%，迫切需要新的治療方法來提高診斷效率，延長患者的生存期。miRNA 是一種長約22 個核苷酸的非編碼RNA，可調控多種癌癥的進展。越來越多的研究報道功能性miRNA 在腫瘤組織和細胞系中表達失調，在多種腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[5]。近年來研究發現，miR-129-5p 在多種腫瘤中異常表達，如膠質瘤[6]、前列腺癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]、腎癌[10]等。然而，miR-129-5 在HCC 中的確切表達和功能仍有待確定。人類婆羅雙樹樣基因-4（SALL4）是一種與腫瘤細胞惡性增殖不可分割的鋅指轉錄因子，本研究旨在探討miR-129-5p 在HCC 中的表達和功能，并分析其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與轉染 正常人肝細胞株（LO2）和人肝癌細胞株（HCCLM3、SK-Hep-1、SMMC-7721、PLC/PRF/5、HepG2、HepG2-luc、Huh7、Hep3B）均購自中國科學院中國細胞庫（上海）。LO2、HCCLM3、SK-Hep-1、SMMC-7721、PLC/PRF/5、HepG2、HepG2-luc、Huh7 和Hep3B 在DMEM 培養基中培養。所有培養基均含有10%胎牛血清（FBS）（Gibco）、1%青霉素和鏈霉素（Gibco）。在37℃含5% CO2的培養箱中培養所有細胞系。細胞轉染miR-129-5p mimic 或mimic control（Gene-Pharma），使用Lipofectamine 3 000（Thermo Fisher）按說明書步驟轉染48 h，用于后續實驗。

1.2 樣本收集 本研究收集了2021 年1 月到12月武警特色醫學中心接受手術的20 例HCC 患者及正常人對照血清。所有患者在手術前均未接受化療或放療。

1.3 CCK8 檢測細胞存活率 收集各組細胞，將細胞種于96 孔板中，密度為5×103個/孔，分別經過24、48、72 h 培養后加入10 μL 的CCK-8 溶液，37℃孵育4 h，用酶標儀測定吸光度（450 nm）。

1.4 細胞克隆形成檢測 在克隆形成實驗中，將1 000 個轉染后的細胞接種在6 孔板中，在37℃、5% CO2條件下培養14 d 后，用PBS 清洗細胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫溶液再染色20 min，顯微鏡下計數克隆形成情況。

1.5 細胞劃痕實驗 通過劃痕實驗來評估肝癌細胞的遷移能力。將各種細胞接種于6 孔板，待細胞融合度達到80%～90%，用20 μL 移液管尖端在底部劃出一條直線。37℃培養箱培養24 h 后，光學顯微鏡下觀察細胞遷移距離。

1.6 Transwell 小室檢測細胞侵襲 在涂有基質膠的Transwell 小室中進行細胞侵襲實驗。將細胞接種在6 孔板中進行轉染。轉染48 h 后，將細胞接種到涂有基質膠的侵入室的上隔室。孵育16 h 后，將侵入插入物底部的細胞染色并在顯微鏡下計數。

1.7 熒光素酶實驗驗證miR-129-5p 與SALL4 的靶向關系 使用StarBase 數據庫（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）預測miR-129-5p 的靶基因。實驗分為4 組：pmirGLO/SALL4-UTR+mimics control、pmirGLO/SA-LL4-UTR+miR-129-5p mimics、pmir-GLO/SALL4-mUTR+mimics control 和pmirGLO/SALL4-mUTR+miR-129-5p mimics。將攜帶SALL4 野生型（pmirGLO/SALL4-UTR）、突變型（pmirGLO/SALL4-mUTR）的質粒分別轉入細胞中，或同時轉入miR-129-5p 模擬物，均培養48 h，隨后吸去培養液，并洗滌細胞，加入細胞裂解液處理5～10 min，然后以3 000 r/min 離心5 min，取上清液進行發光測定。

1.8 RT-qPCR 按照總RNA 提取試劑盒的說明從血清或細胞中提取總RNA，并測定其濃度和純度。然后根據逆轉錄試劑盒將提取的RNA 全部反轉錄為cDNA，進行PCR 擴增，檢測基因表達水平。

1.9 Western 印跡法 采用RIPA 裂解緩沖液（Beyotime），從細胞中分離總蛋白。采用BCA 試劑盒（Beyotime）定量總蛋白。使用10%SDS-PAGE 分離蛋白，然后將蛋白轉移到PVDF 膜上（Thermo Fisher）。用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，細胞膜與一抗孵育過夜：anti-SALL4（1 ∶1 000）、anti-PD-L1（1 ∶1 000）和抗anti-GAPDH（1 ∶10 000）。之后用相應的二抗孵育，最終使用ECL 試劑盒來觀察蛋白條帶，Image J 軟件進行蛋白條帶的灰度分析。

1.10 統計學處理 采用GraphPad Prism 軟件進行統計分析。所有數據符合正態分布，資料采用表示。組間比較采取SNK-t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-129-5p 在HCC 患者血清及肝癌細胞系中的表達水平 與正常對照組相比，HCC 患者血清miR-129-5p 表達量顯著降低（t=13.32，P<0.001）。與LO2 細胞相比，HepG2、Hep3B、HCCLM3、BEL-7402 和QGY-7703 的miR-129-5p 表達量均顯著降低（t=30.35、33.08、37.11、32.87、8.2，均P<0.05）。

2.2 miR-129-5p 過表達抑制肝癌細胞增殖、侵襲和轉移 CCK-8、集落實驗和劃痕實驗表明過表達miR-129-5p 可抑制HCCLM3 細胞的增殖和遷移能力（P<0.05）。Transwell 侵襲實驗顯示，與對照組相比，miR-129-5p mimics 顯著抑制Hep3B 和HCCLM3 細胞的穿膜數量（P<0.05），見圖1 和表1。

表1 各組細胞活力、克隆形成數、凋亡率、遷移、侵襲率比較（n=3，）Tab.1 Comparison of cell viability，number of clone formation，migration and invasive rate of each group（n=3，）

表1 各組細胞活力、克隆形成數、凋亡率、遷移、侵襲率比較（n=3，）Tab.1 Comparison of cell viability，number of clone formation，migration and invasive rate of each group（n=3，）

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圖1 過表達miR-129-5p 抑制肝癌細胞侵襲和轉移（200×）Fig.1 Overexpression of miR-129-5 inhibited invasion and metastasis of HCC cells（200×）

2.3 SALL4 是miR-129-5p 在HCC 中的下游靶點StarBase 預測結果顯示，miR-129-5p 與SALL4 有潛在結合位點，見圖2。隨后，通過熒光素酶實驗以確認miR-129-5p 與SALL4 3′-UTR 區之間的直接結合序列，與pmirGLO/SALL4-UTR+mimics control組相比，pmirGLO/SALL4-UTR+miR-129-5p mimics組相對熒光素酶活性降低[（9.47±0.38）vs.（5.36±0.32），t=13.75，P<0.05]；pmirGLO/SALL4-mUTR+mimics control 組與pmirGLO/SALL4-mUTR+miR-129-5p mimics 組相對熒光素酶活性差異無統計學意義[（9.24±0.30）vs.（9.37±0.43），t=0.228，P>0.05]。

圖2 StarBase 預測miR-129-5p 和SALL4 的結合位點Fig.2 The binding sites of miR-129-5p and SALL4 predicted by StarBase

2.4 過表達miR-129-5p 對靶基因SALL4 蛋白以及HCC 免疫治療相關PD-L1 表達的影響 在HCCLM3 細胞中轉染miR-129-5p mimics 后，檢測SALL4 和PD-L1 的蛋白相對水平，結果顯示上調miR-129-5p 表達后SALL4 [（0.83±0.08）vs.（0.31±0.01），t=12.68，P<0.05]和PD-L1[（0.64±0.08）vs.（0.36±0.02），t=8.798，P<0.05）的蛋白水平明顯降低，見圖3。

圖3 各組HCCLM3 細胞中SALL4 和PD-L1 蛋白表達Fig.3 SALL4 and PD-L1 protein expression in HCCLM3 cells of each group

2.5 miR-129-5p 通過調控SALL4 的表達抑制HCC 細胞的增殖、遷移和侵襲 與mimics control組相比，miR-129-5p mimics+pcDNA3.1 組細胞活力降低，克隆形成數減少，遷移和侵襲率降低（均P<0.05）。與miR-129-5p mimics+pcDNA3.1 組相比，miR-129-5p mimics+pcDNA3.1-SALL4 組細胞活力增加，克隆形成數增多，遷移和侵襲率升高（均P<0.05），見表2 和圖4。

表2 各組細胞活力、克隆形成數、凋亡率、遷移侵襲率比較（n=3，）Tab.2 Comparison of cell viability,number of clone formation,migration and invasive rate of each group（n=3，）

表2 各組細胞活力、克隆形成數、凋亡率、遷移侵襲率比較（n=3，）Tab.2 Comparison of cell viability,number of clone formation,migration and invasive rate of each group（n=3，）

注：*P<0.05；與mimic control 組比較，aP<0.05；與miR-129-5p mimics+pcDNA3.1 組比較，bP<0.05

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圖4 MiR-129-5p 通過調控SALL4 的表達抑制HCC 細胞的侵襲和遷移（200×）Fig.4 MiR-129-5p inhibited the invasion and migration of HCC cells by regulating the expression of SALL4（200×）

3 討論

HCC 細胞的侵襲和轉移是影響患者治療效果及導致死亡的主要原因[11]。miRNAs 作為HCC 的調控基礎，其研究進展為HCC 的發生、發展提供了新的見解。miR-129-5p 通過調控細胞周期、增殖、凋亡、遷移、侵襲和血管生成等生理和病理過程，對多種腫瘤的發生和發展發揮調控作用[12]。在腎癌細胞中，miR-129-5p 促進細胞增殖和侵襲,并通過調控SOX4 通路抑制腎癌細胞[10]。之前有研究報道miR-129-5p 通過靶向TRPM7 和抑制NLRP3 炎癥小體激活緩解心肌細胞缺氧復氧損傷[13]。此外，miR-129的表達可能是前列腺癌患者無生化復發生存的獨立預后標志物，并且miR-129 的過表達通過調節細胞周期調節蛋白的表達水平顯著減弱前列腺癌細胞的增殖[7]。MiR-129-5p 在HCC 中通過直接靶向肝癌來源的生長因子（HDGF）發揮Wnt 信號依賴性的抑瘤功能[14]。本研究發現miR-129-5p 可以靶向SALL4，調控HCC 細胞周期、增殖、凋亡、遷移和侵襲，從而促進HCC 的進展，為HCC 的研究和治療提供了新的治療靶點。

本研究通過生物信息學數據庫分析確定了miR-129-5p 的潛在靶基因為SALL4，并通過熒光素酶報告基因檢測技術發現miR-129-5p 可與SALL4 3′UTR 上的靶點結合。此外，通過檢測轉染miR-129-5p 模擬物后細胞中SALL4 的蛋白表達水平降低，證明SALL4 是miR-129-5p 的靶基因。miR-129-5p 在轉錄后水平調控SALL4 的表達。SALL4 是一種對胚胎干細胞自我更新和維持多能性至關重要的癌胚蛋白[15]，具有阻止干細胞分化和增強干細胞自我更新的能力，因此被認為在多種類型的癌癥中發揮重要作用[16]。據報道，SALL4 高表達的肝癌祖細胞樣亞型與臨床侵襲性和不良預后相關[17]。因此，SALL4 目前被認為是一種新興的候選癌癥生物標志物。研究發現SALL4 和T 細胞共抑制配體PD-L1 的表達水平均與miR-200c 水平呈負相關。通過大樣本肝癌患者生存期回顧分析，發現低表達SALL4 或PD-L1 及高表達miR-200c 的患者具有更長的生存期[18]。

綜上所述，本研究發現miR-129-5p 可通過抑制HCC 細胞的增殖、遷移和侵襲，發揮抑癌基因的作用，miR-129-5p 通過靶向SALL4 抑制HCC 進展。因此，miR-129-5p/SALL4 可能成為HCC 治療的一個有吸引力的靶點。雖然本研究揭示了miR-129-5p/SALL4 軸在HCC 中的抗腫瘤作用，但在未來的研究中仍有一些問題需要改進，例如需要更多的HCC 癌組織和對照組織樣本來證實miR-129-5p 在HCC 中的表達水平，需要在更多的細胞系中再次證實miR-129-5p/SALL4 軸在HCC 中的作用。