乳腺癌轉移演進的關鍵分子ALDH2 體外可視化研究

牛琛，付麗

（天津醫科大學腫瘤醫院乳腺病理科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津 300060）

乳腺癌的發病率已經上升為全球惡性腫瘤的第一位，腫瘤的復發和轉移是患者死亡的主要原因[1-3]。如何能術前精準標記出具有播散和轉移潛能的腫瘤細胞，是解決腫瘤復發和轉移的關鍵[4-5]。目前，組織病理學是診斷腫瘤的金標準，但是其有創、滯后、取材有限導致不能觀察到腫瘤的全貌[6-7]。如果能夠通過分子影像技術準確預判腫瘤范圍及轉移潛能，不但可以指導精準取材，也可以實時指導手術，避免病灶殘留，對患者的診斷、治療以及預后極為重要。近紅外光學成像因其靈敏度高、背景熒光干擾小、組織光損傷較低、無輻射、成本低等優點，在腫瘤診斷、光學手術導航和實時可視化評價療效等方面做出了顯著貢獻[8-10]。

乙醛脫氫酶2（ALDH2）屬于醛脫氫酶家族[11]，在維持腫瘤細胞干性和介導微管抑制劑抗性中起關鍵作用[12-14]。前期研究表明，ALDH2 在浸潤性微乳頭狀癌（IMPC）這種高轉移的乳腺癌組織中高表達，其表達水平與腫瘤細胞的播散、遷移和轉移能力成正比，是患者死亡的獨立風險因素[15]。因此，ALDH2是識別具有播散和轉移潛能腫瘤細胞的重要分子。設計并合成一種脂質體納米探針ALDH2-Cy7@LPFA，評估其在腫瘤細胞中的表達水平，實現在體、無創、精準、高效診斷具有高侵襲和轉移特性的乳腺癌，可為精準診療方案的制定及患者的預后預測提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 人乳腺癌細胞系BT474、MDA-MB-231、T47D、MCF-7 和人正常乳腺細胞MCF-10A 均購自Procell 公司；ALDH2 抗體和GAPDH 抗體購于美國Abcam 公司；DMEM 培養基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗購于美國Gibco 公司；Cy7 購自北京范博生化；超干二甲基亞砜（DMSO）、三乙胺（TEA）購自北京百靈威科技有限公司；乙醚購自國藥集團化學試劑有限公司；無水甲醇（CH3OH）購自天津天力化學試劑有限公司；（2，3-二油?；?丙基）-三甲胺（DOTAP）、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿（DOPC）、1，2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[葉酸（聚乙二醇）]（DSPEPEG2k-folate）、膽固醇（Chol） 購自Avanti Polar Lipids 生物公司。

紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司，TU-1900）、熒光光譜儀（愛丁堡儀器公司，FLS1000）、磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司，DF-101S）、混勻儀（上海仙象儀器有限公司，ELEMS100）、納米粒徑電位分析儀（Malvern，ZEN3690）、臺式高速離心機（eppendorf，5810R）、脂質體薄膜擠出器（加拿大ATS 工業系統有限公司，LEPEX）。

1.2 方法

1.2.1 探針合成及制備 參照文獻方法[16-17]，先將葉酸-NHS 和DSPE-PEG2000-NH2 溶解于PBS中，TEA 為催化劑，室溫攪拌12 h。用透析袋對反應液透析3 次，去除未反應的葉酸，真空冷凍干燥得到Folate-PEG2000。然后，采用薄膜水化法合成脂質體納米顆粒，將二棕櫚酰磷脂膽堿（DPPC）、膽固醇和Folate-PEG2000 混合溶于甲醇/氯仿（9/1，v/v）混合液中，減壓去除有機溶劑，形成脂質干膜。分別將含有ALDH2-Cy7 與ALDH2-Cy5 的PBS 溶液加入脂質干膜中，50℃水化1 h，得到多層脂質體，再用脂質體擠出器（聚碳酸酯膜100 nm）擠出多層脂質體10 次后，得到納米脂質體，最后用透析袋透析3次，去除未包封的ALDH2-熒光基團原料，得到脂質體納米探針ALDH2-Cy7@LP-FA。

1.2.2 細胞培養 人乳腺癌細胞系BT474、MDAMB-231、T47D、MCF-7 和人正常乳腺細胞MCF-10A 在補充有10%胎牛血清的DMEM 中培養，37℃下在5%CO2的培養箱中培養。

1.2.3 免疫組化染色 采用免疫組織化學染色方法分析ALDH2 在腫瘤組織和癌旁組織中的表達情況。4%的多去甲醛（PFA）固定腫瘤組織，連續切取5 μm 厚度的組織切片進行免疫組化染色。染色步驟和評分標準詳見前期實驗步驟[15]。

1.2.4 蛋白質印跡 采用蛋白質印跡法分析ALDH2 在乳腺癌細胞BT474、T47D、MDA-MB-231、SKBR3、MCF-7 和人正常乳腺細胞MCF-10A 中的表達水平。使用苯基甲磺酰氟（PMSF）（#8553，CST）的細胞裂解緩沖液（#9803，CST）裂解乳腺癌細胞。SDS-PAGE 凝膠（10%）分離蛋白質，轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉。將PVDF 膜與ALDH2（ab133306，Abcam，1 ∶1 000）一抗在4℃下孵育過夜。與HRP 耦聯的抗兔IgG（7074 s，CST，1 ∶5 000）在室溫下孵育1 h，使用ECL 檢測試劑盒（P90719，Immobilon）分析蛋白質表達。

1.2.5 流式細胞實驗 將BT474 細胞以2×104密度平鋪到12 孔板，并設置空白對照組。待細胞貼壁后，去除舊培養基，在空白對照組中加入新鮮培養基，實驗組中加入對應的探針，孵育不同時間（0、2、4、6 h）后，再次去除舊培養基，PBS 清洗3次，500 μL 胰酶消化2 min，然后加入500 μL 培養基終止消化。將細胞1 000 r/min 離心3 min，去除上清，然后200 μL PBS 重懸。吹打均勻，流式細胞儀對細胞進行熒光定量。MDA-MB-231 和MCF-10A 細胞組處理方法類似。

1.2.6 激光共聚焦成像實驗 以BT474、MDA-MB-231 細胞作為實驗組，MCF-10A 細胞作為對照組。將BT474 細胞以20 000 個/皿的密度平鋪到共聚焦小皿（35 mm×10 mm）上，5%CO2，37℃培養箱中孵育過夜。待細胞貼壁生長后，去除舊培養基，加入含有ALDH2-Cy7@LP-FA（5 μmol/L）的培養基孵育4 h。隨后去除培養基，PBS 清洗3 次，加入含有Mito Tracker Green FM（50 nmol/L）的培養基孵育20 min以進行線粒體染色，然后PBS 清洗3 次，使用500 μL Hoechst 33 342 溶液孵育10 min 進行細胞核染色，最后PBS 清洗3 次，將各共聚焦小皿分別置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍攝。MDA-MB-231 和MCF-10A 細胞組處理方法類似。

1.2.7 細胞毒性實驗 采用CCK8 法檢測納米脂質體探針的細胞毒性。將傳代培養至對數期的乳腺癌細胞BT474、MDA-MB-231 消化、離心、吹勻，以每孔5×103密度平鋪至96 孔板，在37℃培養箱孵育。隨后去除舊培養基，對照組加入新鮮培養基，實驗組加入用培養基配置的不同濃度的探針（濃度分別為0、5、10、15、20、30 μg/mL），然后分別以100 μL/孔加入96 孔板，在恒溫培養箱中培養48 h。孵育結束后，加入10 μL/孔的CCK8 溶液，將培養板放入培養箱中孵育4 h，之后使用酶標儀檢測每孔的吸光度值（OD），波長設置為450 nm，對腫瘤細胞的存活率進行計算，檢測探針對腫瘤細胞毒性的影響。

1.3 統計學處理 使用GraphPad Prism 6.0 統計軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，蛋白質印跡及其他實驗差異分析，采用獨立樣本的t檢驗，P<0.05 為差異統計學意義。

2 結果

2.1 探針的表征 制備得到粒徑均一分布的葉酸靶向脂質體FA-Lipo，其粒徑大小為（155±2）nm（圖1A）。在不同pH 值條件下均為電中性（zeta 電勢<10 mV）（圖1B）。由于需要遞送的ALDH2 抗體的等電點為7.49，在中性條件下也為電中性。因此通過超聲法制備含有ALDH2-Cy7 的脂質體ALDH2-Cy7@LP。粒徑分析表明其粒徑與原脂質體FA-Lipo 相當，為（155±4）nm（圖1C）。進一步對ALDH2-Cy7@LP 的紫外吸收光譜和熒光發射光譜進行表征，結果表明，脂質體的包載使得標記抗體的紫外吸收和熒光發射分別發生了4 nm 和5 nm的藍移。光譜性質表明（圖1D），Cy7 對ALDH2 的抗體標記成功，脂質體的包載實現了抗體納米化，同時對標記抗體的光譜性質影響很?。▓D1E）。

圖1 ALDH2-Cy7@LP-FA 的表征結果Fig.1 Characterization results of ALDH2-Cy7@LP-FA

2.2 ALDH2 蛋白在不同乳腺癌細胞系中的表達免疫組化對比IMPC 組織與癌旁組織中ALDH2 的蛋白表達差異，發現ALDH2 在IMPC 組織中顯著高表達（圖2A）。通過蛋白質印跡實驗檢測ALDH2 蛋白在6 種乳腺細胞中的表達水平，發現ALDH2 在人正常乳腺細胞MCF-10A 極低表達，在乳腺癌細胞BT474 和MDA-MB-231 中高表達，在T47D、SKBR3、MCF-7 細胞中較低表達（圖2B，BT474：t=29.123，P<0.001；T47D：t=9.512，P<0.01；MDA-MB-231：t=27.162，P<0.001；SKBR3：t=21.279，P<0.001；MCF-7：t=3.628，P<0.05）。

圖2 ALDH2 在乳腺癌組織和細胞的表達水平Fig.2 ALDH2 expression levels in breast cancer tissues and cells

2.3 探針的體外攝取及成像結果 采用流式細胞術分析探針在腫瘤細胞中的攝取情況，將探針與BT474 和MDA-MB-231 細胞共孵育，發現結合率隨時間逐漸增高，在4 h 后達到飽和（圖3A）。流式細胞術檢測MCF-10A、MDA-MB-231 和BT474 細胞的ALDH2-Cy7@LP-FA 探針結合率，與MCF-10A細胞相比，在高表達ALDH2 的BT474 細胞中的結合率最高，MDA-MB-231 細胞次之（BT474：t=9.976，P<0.01；MDA-MB-231：t=12.026，P<0.05）。CCK8 結果顯示，ALDH2-Cy7@LP-FA 探針在濃度高達30 μg/mL 時，BT474 和MDA-MB-231 的細胞存活率仍在80%以上，與對照組相比無統計學差異，并未發現明顯的細胞毒性（圖3B）。

圖3 ALDH2-Cy7@LP-FA 對細胞的攝取及毒性Fig.3 Cellular uptake and toxicity of ALDH2-Cy7@LP-FA

共聚焦顯微鏡結果顯示，ALDH2-Cy7@LP-FA探針熒光與Mito Tracker 線粒體發光高度重疊，提示主要定位在胞漿線粒體。探針BT474 中呈強熒光著色，在MCF-10A 中呈極弱熒光著色，與蛋白質印跡結果一致（圖4A）。共定位實驗表明，探針與線粒體染料Mito Tracker 高度重合，在BT474、MDA-MB-231 中的Pearson相關系數分別高達0.88 和0.78，成功釋放和定位在線粒體（圖4B）。

圖4 ALDH2-Cy7@LP-FA 的成像效果Fig.4 Imaging effect of ALDH2-Cy7@LP-FA

3 討論

2020 年全球確診了230 萬例乳腺癌新病例（占所有腫瘤的11.7%），其已超過肺癌，成為全球最常見的腫瘤，是女性腫瘤死亡的主要原因。乳腺癌的局部復發或遠處轉移是臨床致死的主要原因，尋找腫瘤特異性靶向分子，利用分子影像學技術實現在體、精準標記播散及轉移細胞是提高患者生存率的關鍵。

在過去的幾十年里，醫學成像技術飛速發展，在臨床腫瘤學中發揮著核心作用。分子成像不僅可以可視化腫瘤在體內的位置，而且能夠可視化影響腫瘤行為或治療反應的特定分子的表達以及生物過程（如凋亡、血管生成和轉移）[16]。其中，近紅外熒光分子影像技術具有高靈敏度、高分辨率、無輻射、低成本等優點，能夠在多水平對關鍵分子靶標進行體內成像，在術前提供腫瘤的精準定位信息，并適用于手術導航，實現對腫瘤的實時監測和精準切除[19-20]。菁染料是近紅外熒光染料中最常用的一類熒光染料，其摩爾吸光系數在熒光染料中是最高的，其中Cy7 的吸收在近紅外區背景非常低，是熒光強度最高、最穩定的長波長染料[21-22]，特別適合代替放射性元素用于活體小動物體內成像[23-24]。

課題組前期對IMPC 腫瘤細胞團全基因組測序，發現IMPC 組織中具有高轉移潛能的腫瘤轉移種子細胞，并鑒定出了腫瘤轉移種子細胞演進的3個關鍵分子：ALDH2、免疫球蛋白超級家族9 號成員（immunoglobulin superfamily member 9，IGSF9）和PR結構域家族16 號成員（PR-domain containing 16，PRDM16）。其中，ALDH2 在IMPC 組織中高表達，提示ALDH2 是促進IMPC 高侵襲和轉移的種子基因。因此，設計ALDH2 靶向熒光探針標記體內高轉移潛能的腫瘤細胞，可實現在體腫瘤細胞的定位，并可評估腫瘤細胞的轉移潛能。

ALDH2 屬于醛脫氫酶家族，位于線粒體。早期研究表明其主要功能是將乙醛代謝成無毒的乙酸，參與乙醇氧化代謝過程[25]。近年來，多研究表明ALDH2 在腫瘤發生、發展過程中發揮重要作用，ALDH2 失活或活性降低使乙醛在體內蓄積，過量的乙醛與谷胱甘肽結合抑制抗氧化防御系統，增加體內的活性氧簇（ROS），促進氧化應激反應，從而導致腫瘤的侵襲與轉移[26]。多項研究表明，ALDH2 在多種不同類型的腫瘤中表達增加，且與不良預后顯著相關。Chen 等[12]研究表明，ALDH2 高表達可增強肝癌細胞的增殖和侵襲能力。Ramakrishnan 等[27]研究發現，在浸潤性膀胱癌中ALDH2 高表達的亞群具有侵襲性表型。Aboulouard 等[28]通過對子宮內膜癌和其前哨淋巴結的臨床樣本進行空間蛋白組學測序分析，發現了高表達分子ALDH2 更多在子宮內膜癌的Ⅱ級和Ⅲ級中表達，故被認為是腫瘤轉移的關鍵分子之一。

ALDH2 不僅在IMPC 這種高轉移的乳腺癌中高表達，還與腫瘤細胞的轉移能力成正比。ALDH2在乳腺正常組織中低表達，在乳腺癌中高表達，其蛋白表達水平與腫瘤細胞的淋巴結轉移呈正相關，與患者的極差預后呈負相關，是患者死亡風險的獨立預后因素。以上研究結果均顯示ALDH2 是識別具有轉移潛能腫瘤細胞的重要候選分子，使ALDH2體內成像，評估其在腫瘤細胞中的表達水平，可實現精準高效的病理診斷。另外，ALDH2 體內成像可為術中精準、徹底地切除腫瘤提供依據。

本研究依據前期研究鑒定出腫瘤轉移的關鍵分子ALDH2，對脂質體納米表面修飾Folate 并包載ALDH2 抗體，構建高靈敏、高特異性的線粒體靶向熒光分子探針，并借助近紅外分子影像技術，識別具有高侵襲轉移潛能的腫瘤干細胞。同時選取人源乳腺癌細胞系具有高侵襲/轉移能力強的MDAMB-231（三陰型）和BT474（Luminal B 型）與探針共孵育，評估探針的體外靶向結合能力。結果顯示，ALDH2-Cy7@LP-FA 可特異性靶向線粒體中的ALDH2，選擇性結合ALDH2 高表達癌細胞，共定位分析顯示該探針在線粒體中特異性積累，其線粒體定位能力優異。且探針對細胞的毒性極低，具有良好的生物相容性。未來將進一步完善在體內實驗的驗證。希望可以精準顯像具有轉移潛能的腫瘤細胞和癌灶邊界，實現檢測ALDH2 過表達的早期乳腺癌，對腫瘤和轉移灶進行精準全切除。此外，ALDH2同樣在子宮內膜癌、肺癌、肝癌等中參與腫瘤細胞的增殖、轉移過程，被認為是腫瘤轉移的關鍵分子之一。因此，基于ALDH2 合成的靶向分子探針可能在多種腫瘤中具有廣泛的應用價值。